АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА

Химико-токсикологический анализ в ветеринарной токсиколо­гии имеет решающее значение. При установлении диагноза на от­равление, изучении миграции токсических веществ в объектах ок­ружающей среды и организме животных, проведении ветеринарно-санитарной оценки кормов и продуктов питания используют, как правило, только химико-аналитические методы исследования. Особенно их значение возросло за последние годы, когда стали уделять особое внимание охране окружающей среды, в системе которой большое место занимает мониторинг — накопление фак­тических данных по уровню загрязнения объектов окружающей среды токсическими веществами различного происхождения.

По данным Гунтера (1977), чувствительность аналитических методов определения пестицидов за 25 лет (1941 — 1965) выросла в десятки тысяч раз. Если в 1941 г. пределы обнаружения большин­ства токсических веществ составляли 10 мг/кг, то в 1965 г.— 0,1 мкг/кг.

В настоящее время для анализа остатков химических веществ в объектах окружающей среды и биологическом материале исполь­зуют современные физико-химические методы, такие, как тонко­слойную и газожидкостную хроматографию, ультрафиолетовую, инфракрасную и атомно-абсорбционную спектрометрию, масс-спектрометрию и хромато-спектрометрию.

Современные методы исследования должны быть по возмож­ности специфичными, т. е. позволяли бы открывать искомое ве­щество в присутствии других аналогичных соединений, быть дос­таточно чувствительными и позволяли бы определять миллион­ные доли вещества в 1 кг субстрата. Особенно это важно для мето­дов, предназначенных для санитарной оценки кормов и продуктов животноводства, а также для изучения динамики остатков пести­цидов в воде, растениях и организме животных.

Степень определения химических токсикантов должна состав­лять не менее 60 % от количества стандартного вещества, внесен­ного в пробу. Методы должны быть удовлетворительно точными (не менее ± 20 %) и хорошо воспроизводимыми.

Методы определения токсических веществ в патологическом материале, объектах окружающей среды, кормах и продуктах пи­тания животного происхождения включают в себя выделение ток­сического вещества из пробы. Выделение яда из пробы может быть проведено путем мокрого или сухого озоления, отгонки с во­дяным паром или же экстракцией одним или несколькими орга­ническими растворителями.

Сухое озоление проводят под действием высокой температуры

(до 500° С) в муфельной печи. Этот метод в основном используют для выделения металлов.

Мокрое озоление применяют значительно чаще и проводят при помощи концентрированных неорганических кислот, чаще всего смеси азотной, серной кислот и окислителей.

Выделение токсических веществ методом отгонки с водяным миром или дистилляции используют для легколетучих химичес­ких соединений. Сущность метода заключается в том, что пробу тщательно измельчают до кашицеобразного состояния или же разрушают неорганической кислотой, разбавляют водой, а затем воду перегоняют, нагревая колбу или подавая в нее пар от парообразователя. Токсические вещества переводятся в дистиллят.

Чище других в ветеринарной практике выделяют токсические вещества путем их экстракции из пробы органическими раствори­телями. Для этого пробу тщательно измельчают, помещают в колбу и затем заливают одним или несколькими органическими растворителями. Объем органического растворителя должен быть не менее, чем в 2 раза больше массы или объема пробы. Экстракцию токсиканта проводят путем выдерживания пробы с органическим растворителем в течение 20—24 ч, перемешивания на шюттель- аппарате и течение 1—2 ч или смешивания в течение нескольких минут при большой скорости вращения перемешивающего устройства (ультратораксы, омнимиксары и др.). Последний способ предпочтителен, так как при этом образуется гомогенная масса, в которой создается наиболее тесный контакт органического растворителя с субстратом, а следовательно, наиболее полно извле­каются токсические вещества, содержащиеся в пробе. Для этой цели также используют аппарат Соксклета, в котором токсическое вещество экстрагируется при многократном промывании субстрата кипящим органическим растворителем. Аппарат Соксклета обеспечивает более полное извлечение токсиканта из пробы по сравнению с другими методами.

При любом способе выделения токсического вещества в экстракт переходит значительное количество примесей, мешающих определению: жиры, пигменты, воск, белки, соли и др. Для освобождения экстракта от этих веществ используют различные способы очистки: путем омыления, вымораживания, осаждения, перераспределения из одного органического растворителя в другой помощью специальных колонок и др. Последние зависят от вида анализируемого соединения и субстрата, в котором он находится.

Дли того чтобы повысить чувствительность метода анализа, экстракты концентрируют до небольшого объема, достаточного для проведения исследований данным методом. Обычно конечные объемы экстрактов составляют 0,5—5 мл. Для концентрирования используют специальные аппараты Кудерна—Данича, вакуум- ротационные испарители. Концентрирование также можно прово­дить в токе воздуха или азота. В практических условиях наиболее приемлемым способом является концентрирование в токе воздуха. Для этого экстракт заливают в фарфоровую выпарительную чаш­ку, ставят ее под шторку вытяжного шкафа и включают тягу. При определении высоколетучих веществ при концентрировании воз­можны значительные потери яда, поэтому при этой операции не­обходимо выполнять следующие требования: не концентрировать конечные экстракты при повышенной (выше 40 °С) температуре, не упаривать досуха очищенные экстракты.

Индикацию токсичных веществ проводят следующими основ­ными методами.

Биологические методы. Применяют главным образом для опре­деления некоторых пестицидов и микотоксинов. Они основаны на чувствительности низших животных, растений или тканей к действию токсического вещества. Так, к инсектицидам и акарицидам наиболее чувствительны различные членистоногие. Чаще дру­гих для определения инсектоакарицидов используют комнатных мух, мух-дрозофил, личинок комаров и рачков-дафний. Для опре­деления микотоксинов применяют кожные пробы на кроликах или аквариумных рыбах гуппи.

Некоторые из микотоксинов, в частности трихотецены и дру­гие, продуцируемые грибом Fusarium sporotrihioides, обладают очень сильным дерматоцидным действием, поэтому реакция кожи является специфической по отношению к метаболитам этих видов грибов. Из всех позвоночных животных наиболее чувствительны по отношению к большинству токсических веществ рыбы, поэто­му их используют для определения не только микотоксинов, но и многих других токсикантов.

Биологические методы индикации обладают высокой чувствительностью, однако в большинстве своем они неспецифичны и не позволяют установить вид токсического вещества. Однако эти ме­тоды широко применяют для общей токсикологической оценки кормов при отравлениях животных на первой стадии лаборатор­ного токсикологического исследования. С помощью этих методов можно установить отравление и исключить заболевания другой этиологии.

Биохимические методы. Основаны на подавлении некоторыми токсическими веществами активности отдельных биохимических систем. В ветеринарном токсикологическом анализе наиболее ча­сто применяют ферментный метод определения фосфорорганических и карбаматных инсектицидов. Он основан на том, что со­единения этих групп в условиях in vitro подавляют активность холинэстеразы. Чувствительность метода при определении некото­рых ФОС достигает 0,01—0,001 мг/кг. Однако эти методы обладают групповой специфичностью и позволяют установить всю группу в целом, не давая возможности установить вид ФОС. Кроме этого некоторые ФОС, в частности производные тио- и дитиофосфорных кислот, очень слабо ингибируют активность фермента in vitro и нуждаются в предварительной активации.

Химические методы. Основаны на количественном определении осадка или окрашенного комплекса, образуемого при взаимодействии открываемого вещества с другим химическим соединением. Химические методы анализа, применяемые в ветеринарной токсикологической практике, основаны на осаждении, титрометрии, колориметрии,спектрофотометрии.

Реакция осаждения базируется на образовании нерастворимого в воде осадка при взаимодействии открываемого химического вещества с другим химическими соединением, вводимым в экстракт. По реакции осаждения определяют некоторые алкалоиды, натрия хлорид, ТМТД и другие токсические вещества. Однако ме­тоды определения ядовитых веществ этой реакцией имеют низкую чувствительность, недостаточную специфичность и точность, поэтому их применяют ограниченно.

Более широко используют титрометрические методы. Примером может служить определение натрия хлорида при осажде­нии хлоридов серебра нитратом с последующим титрованием избытка серебра роданидом аммония в присутствии в качестве индикатopa железоаммонийных квасцов. Но и титрометрические методы недостаточно чувствительны и утрачивают свое практическое значение в связи с развитием новых, более совершенных способов.

В практике химико-токсикологических исследований находят широкое применение колориметрические методы, основанные на определении интенсивности окраски цветных комплексов, обра­зующихся при взаимодействии открываемого вещества с другим химическим соединением, вводимым в раствор. В последние годы все чаще используют фотоэлектроколориметрические методы, при которых интенсивность окрашивания цветных комплексов определяют с помощью фотоэлектроколориметра. По чувствительности и точности колориметрические методы превосходят основанные на осаждении и титрометрии способы.

Физико-химические методы. К физико-химическим методам относят различные методы хроматографии (колоночную, бумажную, тонкослойную, газожидкостную и жидкостную), полярографию, ультрафиолетовую и инфракрасную спектрометрию, атомную абсорбцию, методы нейтронно-активационного анализа.

Из хроматографических методов в практике ветеринарно-токсикологического исследования наибольшее применение находят тонкослойная и газожидкостная хроматографии (ТСХ и ГЖХ), разработанные русским ученым М. С. Цветом (1903). Эти методы являются одними из основных в аналитической химии. Преимущество их состоит в том, что они обладают высокой специфичностью и чувствительностью и позволяют за один аналитический прием определить сразу несколько химических соединений. Мож­но сложную смесь химических соединений, содержащихся в ана­лизируемой пробе, разделить на отдельные вещества, а затем каж­дое из них определить каким-либо химическим или физическим методом.

Тонкослойную хроматографию наиболее широко применяют в практических лабораториях. Принцип полуколичественного ме­тода состоит в том, что смесь химических веществ, содержащихся в анализируемой пробе, наносят на пластинку и разделяют в тон­ком слое инертного порошка (селикагель, окись алюминия и др.) с помощью смеси органических растворителей (подвижный ра­створитель). Пластинку опрыскивают раствором проявляющего реактива, в результате чего на ней появляются в виде окрашенных пятен исследуемые химические соединения. Идентифицируют от­крытые вещества по величине Rf— частному от деления расстоя­ния, пройденного искомым веществом от точки нанесения (линия старта) до места дислокации, к расстоянию, пройденному под­вижным растворителем. Количество открываемого вещества опре­деляют по интенсивности окраски пятна и его размерам.

В практике ветеринарных химико-токсикологических исследо­ваний тонкослойная хромотография используется для определе­ния многих пестицидов, алкалоидов, микотоксинов, органичес­ких соединений тяжелых металлов. Метод прост по технике ис­пользования, не требует сложного оборудования, обладает доста­точно высокой специфичностью и чувствительностью (0,05— 1,0 мкг в пробе).

Газовую хроматографию применяют для одновременного разде­ления смеси химических веществ, их последующей идентифика­ции и количественного определения. Разделение смеси осуществ­ляют на стеклянных или металлических колонках длиной 1—3 м, заполненных твердым адсорбентом с нанесенной на него жидкой фазой. В качестве последней чаще всего используют высокомоле­кулярные жидкости с высокой температурой кипения (полиэтиленгликоли, силиконовые масла и др.). Подвижной фазой служит инертный газ (азот и др.).

Индикацию разделенных химических веществ осуществляют с помощью детектора. В газовых хроматографах, предназначенных для анализа токсических веществ, чаще всего используют детектор электронного захвата (ДЭЗ), термоионный детектор (ТИД), пла­менно-фотометрический детектор (ПФД). Абсолютная чувстви­тельность детектирования различных химических соединений до­стигает 0,01—0,02 мкг в пробе, относительная чувствительность — 0,1—0,5 мкг/кг. В практике химико-токсикологического анализа газовую хроматографию применяют для открытия многих пестицидов, органических соединений ртути, полихлорированных бифенилов и других токсических соединений. Однако возможности газовой хроматографии далеко не исчерпаны. Газовая хроматография, в частности ГЖХ, имеет некоторые недостатки: не позволяет прямым способом разделить и идентифицировать вещества, не обладающие летучестью и не способные прямым путем переходить в газообразное состояние.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) основана на том же принципе, что и газожидкостная, с той лишь разницей, что разделение вещества происходит в двух несмешивающихся жидкостях. Одна из них — обычно высокомолекулярная неполярная жидкость—служит неподвижной фазой, вторая — низкомолекулярная — подвижной. Подвижную фазу под высоким давлением пропускают через неподвижную, в результате чего сложная смесь разделяется на отдельные соединения. С помощью ВЭЖХ можно разделить твердые и жидкие смеси, не превращая их в газообразное состояние, как это бывает при ГЖХ.

Недостаток этого метода — ограниченное число детектирующих систем. Серийные жидкостные хроматографы, выпускаемые отечественными фирмами, оборудованы лишь одним детекто­ром- спектрофотометром.

Спектральные методы. Наибольшее применение в практике анализа токсических веществ получила ультрафиолетовая спектрометрия. Принцип работы ультрафиолетового спектрофотометра основан на поглощении растворами химических веществ лучей в ультрафиолетовом спектре. Этот метод принципиально отличает­ся от фотоэлектроколориметрического тем, что оптическая плотность анализируемых экстрактов измеряется в ультрафиолетовой области спектра.

Инфракрасная спектрометрия основана на поглощении химическим веществом лучей в инфракрасной области спектра. Сте­пень поглощения неодинакова у разных структурных групп химического вещества, поэтому инфракрасная спектрограмма представляет собой конгломерат пиков с большим количеством вер­шин. Инфракрасную спектрометрию, как правило, не используют для определения микроколичеств химических веществ в биологических субстратах, а применяют главным образом для расшифров­ки структуры выделенного химического вещества.

Атомно-абсорбционная спектрометрия основана на поглощении отдельными атомами химических элементов световых лучей в определенной области спектра. Поэтому исследуемые химические вещества вначале минерализуются, а затем в состоянии раствора подвергаются воздействию лучами определенной длины, соответствующей поглощающей способности того или иного элемента. По степени поглощения лучей определяют его количественное со­держание. Этот метод находит широкое применение главным образом при определении металлов и металлоидов (ртуть, свинец, кадмий, медь, цинк и др.).

Нейтронно-активационный анализ основан на облучении пробы ней фонами, в результате чего возникает наведенная радиация, по степени которой и определяют количественный уровень содержа­ния исследуемого элемента. Однако метод требует сложного обо­рудования, поэтому малоприемлем в практических условиях.

Критерии оценки методов определения остатков токсических веществ. Методы определения остатков токсических веществ в объектах ветеринарного надзора обычно характеризуют по чувствительности, точности и определяемости.

Чувствительность метода — наименьшее количество химического вещества, открываемое при заданных условиях метода. Она может быть абсолютной и относительной. Абсолютная чувствительность — наименьшее количество вещества, кото­рое можно определить данным методом или реакцией, лежащей в ее основе. Так, с помощью газожидкостной хроматографии можно определить 0,05 нг ТХМ-3. Однако для исследования используют лишь часть аликвоты, предназначенной для анализа, которая со­ответствует определенной части пробы. Поэтому для полной ха­рактеристики метода целесообразно ввести такое понятие, как от­носительная чувствительность — чувствительность по отношению к одному и тому же объему или массе. Обычно относительную чувствительность принято выражать в мг/кг пробы.

Точность метода. Под точностью метода, как правило, понимают различие между истинной и экспериментально найден­ной величиной. При этом за истинную величину может быть при­нято количество вещества, вносимого в пробу из стандартного ра­створа. Поэтому точность метода может быть охарактеризована как разница между количеством вещества, внесенного в пробу и определенного данным методом аналитического исследования. Точность — это величина стандартного относительного отклоне­ния, установленного по результатам воспроизведения методики при внесении данного количества вещества в пробу.

Точность метода соответствует величине стандартного относи­тельного отклонения и вычисляется по формуле _

∑(Х-Х)²

σ (стандартное отклонение)=√ N – 1

_

где N —число измерений; X —примерная величина; X —среднее арифметичес­кое; ∑ — знак суммирования.

_

Сначала рассчитывают среднее арифметическое X, затем абсо­лютную

_

величину разности между X и значением отдельного из­мерения; разность возводят в квадрат и эту величину суммируют. Сумму делят на N— 1. Квадратный корень из полученного резуль­тата представляет собой стандартное отклонение σ.

Однако точность метода может быть вычислена применительно к определяемости. Поэтому сначала устанавливают определяемость метода, а затем его точность по показателю относительного стандартного отклонения.

Определяемость метода — средняя величина, показывающая процент открытия вещества в пробе после его внесения из стандартного раствора в количествах, соответствующих пределу определения и максимально возможному уровню содержания.

Дата добавления: 2015-02-06 | Просмотры: 1217 | Нарушение авторских прав