АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Серологічні методи діагностики

3.8.1. Імуноферментний і радіоімунний аналізи (ІФА і РІА)

ІФА і РІА – імунологічні реакції між антигеном і гомологічними антитілами, які відносяться до твердофазних імуносорбентних методів дослідження.

ІФА і РІА проводяться у ряд послідовних етапів:

- перший відомий компонент реакції (це можуть бути антитіла або антиген) сорбують на тверду фазу (лунки полістиролових планшетів);

- досліджувані проби (з антигенами або, відповідно, антитілами) вносять в рідкому, розчиненому вигляді та інкубують;

- відмивають тверду фазу від незв’язавшихся неспецифічних антитіл (антигенів), на ній залишається тільки прореагувавший комплекс антиген-анитіло;

На кінцевому етапі в ІФА і РІА використовують антитіла (антигени), мічені ферментом (в ІФА) або радіонуклідом, звичайно ¹²⁵І (у РІА).

У багатьох тест-системах, наприклад, ІФА-ВІЛ ½-О, ІФА-анті-ДЕЛЬТА М, ІФА-АНТІ-HEV та інших до зв’язаного комплексу “антиген-антитіло” вносять імуноферментний кон’югат, мічений пероксидазою хрону. Окрім пероксидази хрону в різних тест-системах ІФА використовують і інші природні ферменти – лужну фосфатазу, b-лактазу, каталазу тощо.

Після наступного відмивання незв’язаного кон’югата до лунок планшету додають забарвлюючий субстрат пероксидази – ортофенілендіамін..

У ІФА результати визначають шляхом візуального або інструментального визначення інтенсивності забарвлення компонентів реакції (за допомогою рідера або спектрофотометра), а у РІА – за рівнем радіоактивності (за допомогою g-лічильників).

У ІФА використовують субстрати, що під дією ферменту переходять у забарвлену розчинну (1) або нерозчинну (2) форму.

До групи 1 належать ортофенілендіамін, парааміносаліцилова кислота, хлоронафтол, р-нітрофенілфосфат та інші. До групи 2 відносяться бензидин, діамінобензидин.

Технологія одержання тест-систем ІФА і РІА має основними етапами

- одержання вірусного антигена;

- одержання гіперімуної сироватки та противірусних антитіл, мічених ферментом, або I¹²⁵.

Одержання вірусних антигенів грунтується на застосуванні традиційних (культивування вірусів) і нетрадиційних (біотехнологія та хімічний синтез) методів. Природні антигени застосовують у вигляді нерозведених віріонних препаратів, окремих структурних білків вірусів, клітин тканин, інфікованих вірусом, або лізатів інфікованих клітин. Працюючи з вірусами, що погано або зовсім не культивуються, використовують біологічний матеріал від хворих або померлих від вірусної інфекції людей та тварин. НВ-антиген одержують із плазми носіїв віруса гепатиту А, кишкові віруси – з калу хворих, вірус гепатиту D (дельта-агент) – з печінки людей, які померли від дельта-гепатиту, і з печінки експериментально інфікованих бабаків. Синтетичні антигени – у вигляді пептидів, одержаних шляхом мікробіологічного або хімічного синтезу. Так, під час серологічної діагностики ВІЛ-інфекції (СНІДу) в ІФА, крім природного антигену, одержуваного за допомогою культивування ВІЛ у культурах Т-лімфоцитів, використовують хімічно синтезований пептид пептоскрин.

У набір для імуноферментного аналізу вірусу імунодефіциту людини – “ІФА-ВІЛ ½-0” входить суміш рекомбінантних поліпептидів – аналогів поліпептидів ВІЛ-1 та ВІЛ-2 (Env ВІЛ-1, Gag ВІЛ-2, Env-ВІЛ-3), синтезованих у бактеріях кишкової палички (Eschеrichia coli). Ці пептиди повністю біологічно безпечні, але присутність у тест-системі деяких біологічних компонентів (сироваток, плазми крови) та хімічних речовин потребує реалізації правил безпеки:

- робота повинна проводитись у спеціально обладнаному приміщенні;

- необхідно працювати у гумових рукавичках;

- розчини не піпетувати ротом;

- усі рідкі відходи обробляти 4% розчином хлораміну або 6% розчином перекису водню на протязі 3 годин;

- усі тверді відходи збирати в спеціальний контейнер і потім автоклавувати 1 годину при 120^оС;

- інструменти, прилади та поверхня, на яких проводився аналіз, необхідно до та після роботи протирати 70%-вим етанолом.

- Вірусні антигени, які використовуються в ІФА і РІА як стандартні антигени (тобто позитивний контроль антигену) мають відповідати певним вимогам. Сорбований на твердій фазі антиген має бути очищеним. Очищення вірусу проводять за допомогою методів ультрацентрифугування, хроматографії та ультрафільтрації.

Концентрація вірусного антигену становить 10 – 20 мкг/мл. Коли працюють з особливо небезпечними вірусами (Ласса, ВІЛ та ін.), використовують неінфекційні препарати, інактивовані формаліном, дією УФ-опромінення, детергентів тощо.

Джерелом одержання противірусних імуноглобулинів для конструювання імуносорбентних тест-систем є поліклональні імуносорбентні сироватки або асцитичні рідини, моноспецифічні сироватки (проти окремих структурних білків вірусу), моноклональні антитіла (антитіла певного класу проти конкретної антигенної детермінанти вірусу). Використовують також жовтки яєць імунізованих курей, сироватки крові реконвалесцентів (у разі вірусного гепатиту А) та носіїв (у разі ВІЛ-інфекції). Імуноглобуліни використовують в концентрації 2 – 10 мкг/мл.

До переваг твердофазних імуносорбентних методів належить висока чутливість і специфічність, швидкість, точність і відтворюваність, можливість стандартизації одержаних даних, дослідження мікрооб’ємів, відносна простота системи реєстрації результатів.

Дещо нижча чутливість ІФА (у 5 – 10 разів) порівняно з РІА зумовлена меншою чутливістю методів виявлення забарвлених молекул, ніж визначення радіоактивності.

Чутливість тест-систем визначають шляхом титрування антигену (референс-препарату) з відомою концентрацією з білком (або вірусними частками), що становить 1 – 5 нг. Під чутливістю розуміють також кількість (%) позитивних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, у яких містяться (за даними більш чутливого методу) противірусні антитіла.

Специфічність визначають як кількість (%) негативних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, що не мають противірусних антитіл. Крім того, специфічність можна розуміти як можливість тонкої імунологічної диференціації вірусних антигенів і антитіл до них.

Висока специфічність імуносорбентних тестів визначається характеристикою антитіл, використовуваних для конструювання детекторних тест-систем, і проявляється у можливості диференціації вірусних антигенів на групо-, підгрупо-, типо-, підтипо- та штамоспецифічні, а також у виявленні антигенних варіантів вірусу навіть у межах одного штаму.

Твердофазні імуносорбентні методи використовують для експрес-діагностики, виявлення вірусного антигена у досліджуваних пробах або противірусних антитіл класу М у сироватці крові хворого в гострий період інфекції.

Ретроспективну серологічну діагностику використовують за умови роботи з кількома вірусними інфекціями (грип, парагрипозні, аденовірусні, ентеровірусні та інші інфекції). Грунтується вона на виявленні збільшення титру противірусних антитіл у 4 рази і більше під час дослідження парних сироваток крові; при вірусних гепатитах A, B, C, D, E, ВІЛ-інфекції та деяких інших.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 1508 | Нарушение авторских прав