АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

А) Первичные культуры клеток

Однослойные культуры клеток называют первичными, если они способны размножаться только в первой генерации, а их субкультуры удаётся получить далеко не всегда. Поэтому каждый раз для приготовления первичных культур клеток берут исходный материал - эмбриональные или зрелые ткани животных, птиц или человека.

Методика получения первичных культур фибробласпгов куриного эмбриона:

1. Яйца, инкубированные 7-11 дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка.

2. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка.

3. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона обмывают 3-5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.

4. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм³) пипеткой переносят в пробирку.

5. Проводят 2-3 кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2-3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают.

6. К отмытой ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемешивают содержимое пробирки с помощью "пипетирования" (многократного насасывания и выдувания
жидкости пипеткой) или энергичного встряхивания. Под действием трапсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной.

7. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата
лакталъбумина. Проводят центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10-15 минут.

8. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2-3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают. Чтобы клетки вновь оказались во взвешенном
состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.

9. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив концентрацию клеток во взвеси, ее разводят гидролизатом лактальбумина до 400000 клеток
в 1 мл.

10. Смесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 37° С в наклонном положении под углом 5°.

Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки -фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образуя монослой. При правильной технике приготовления культуры обычно образуется сплошной пласт клеток, при нарушении условии культивирования - рост менее интенсивный, клетки растут отдельными островками; такие пробирки малопригодны для работы.

Первичные культуры клеток, получаемые из другого исходного материала - почечной ткани животных, эмбриона человека и др., готовят аналогично, с некоторыми техническими изменениями, не имеющими принципиального значения.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 1154 | Нарушение авторских прав