АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Оборудование и реактивы для окраски флюорохромными красителями

Для окраски препаратов флюорохромными красителями необходимы:

· Раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

· Специальный штатив («рельсы») для окраски мазков на предметных стеклах;

· Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

· Газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;

· Металлический стержень для приготовления ватного тампона, используемого вместо горелки для фиксации препарата перед окраской, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;

· Раствор флюоресцентных красителей;

· Раствор для обесцвечивания мазков;

· Раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;

· Емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;

· Штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

При окраске флюорохромными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться фильтровальной бумагой!

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

Микроскопию производят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски люминесцентными красителями и высыхания мазков. В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

— избегать неполного обесцвечивания; т.к. кислотоустойчивые микобактерии практически не обесцвечиваются;

— не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

Мазки, которые использовались для флуоресцентной микроскопии, в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.

В нашей стране наибольшее распространение получили следующие методы окраски микобактерий люминесцентными красителями:

10.4.1. Метод окраски аурамином ОО и родамином С
Реактивы:

· Спирт этиловый марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

· Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

· Метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

· Аурамин ОО, (аурамин О – Sigma);

· Родамин С, ТУ-6 –09-2463-77 (родамин В – Sigma);

· Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Раствор аурамина - родамина:

Каждый краситель растворяют отдельно в 150 – 200 мл дистиллированной воды и помещают в термостат при 37⁰С на 18 – 24 часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем до 1000 мл. Приготовленный раствор красителей хранят в емкости из темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:

Концентрированная соляная кислота 3 мл

Этиловый спирт 96^о 97 мл

Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл этилового спирта.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот!

Раствор 3. Гаситель фона:

Метиленовый синий хлорид 25 мг

Вода дистиллированная 100 мл

В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового синего хлорида.

Хранение растворов. Написать на этикетке название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Растворы желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед использованием растворов их просматривают для исключения преципитата. Если последний обнаружен, раствор можно профильтровать.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы «рельсы» для окраски так, чтобы они не касались друг друга;

2. Мазки заливают раствором 1 на 1 час;

Не нагревать мазки и не использовать полоски фильтровальной бумаги!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;

4. Обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3 мин;

5. Промывают дистиллированной водой;

6. Гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 60 сек. Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой.

7. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

10.4.2. Метод окраски аурамином О (Hagemann P.K., 1938; CDC,1985; WHO,1998)

Реактивы:

· Спирт этиловый марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

· Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

· Фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

· Аурамин О, Sigma (2465-27-2);

· Акридиновый оранжевый, C.I.46005; ИЛИ

Перманганат калия, ГОСТ 10163-76;

· Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

· Безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:

Аурамин 0,1 г

Этиловый спирт 96⁰ 10 мл

Растворить аурамин в спирте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Раствор фенола:

Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41⁰С) и растворить его в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.

Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:

Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к 70⁰ этиловому спирту.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот!

Растворы 4. Гасители фона:

Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.

а) Раствор перманганата калия:

Растворить перманганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

б) Раствор акридинового оранжевого:

Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый.

Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы «рельсы» для окраски так, чтобы они не касались друг друга;

2. Мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут;

Не нагревать мазки и не использовать полоски фильтровальной бумаги!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;

4. Обесцвечивают обесцвечивающим раствором 3 (0,5 % раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут.

5. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски.

6. Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут. При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минуты. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться.

7. Мазки промывают дистиллированной водой.

8. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

10.4.3. Хранение приготовленных мазков

Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если больной находится это время в стационаре. Окрашенные флуоресцентными красителями мазки чувствительны к ультрафиолетовому свету, особенно во время процесса бактериоскопии, и способны за несколько секунд обесцветиться. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости делают паузу, перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к полному восстановлению препарата.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 894 | Нарушение авторских прав