АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Ионный состав

Прочитайте:
  1. I. Организационный момент
  2. I. Организационный момент.
  3. III. Изучение геологического строения месторождений и вещественного состава полезного ископаемого
  4. IX. СОСТАВЛЕНИЕ ПРОГРАММЫ – часть 2
  5. V. Информационный блок для самостоятельной позааудиторной разработки темы
  6. А) Препараты простого состава
  7. Азотистые основания, входящие в состав НК
  8. Аллохтонная микрофлора полости рта представлена микробами, присущими другим областям. В её состав входят виды, обычно обитающие в кишечнике или носоглотке.
  9. Анальная эротика и кастрационный комплекс
  10. АТТЕСТАЦИОННЫЙ ЛИСТ
Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды длякультивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли со­боймодификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержанияжизни клеток – Na+, К+, Са2+, Mg2+, и , растворенные вбикарбонатном буфере (НCO3). Также добавлялись антибио­тики дляпредотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина илисыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка использует­ся бычий иличеловеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческаясыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческаятрубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Болеесложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и былиразработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивированияэмб­рионов различных видов млекопитающих.Энергетическими субстратами для ооцитов и эмб­рионов млекопитающих вкультуральной среде обыч­но служат пируват, лактат и глюкоза, причемусвое­ние глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии несколькихклеточных делений, а до это­го предпочтительным источником энергии служитпи­руват.Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется ихприсутствием в жидкости яйце­водов многих видов млекопитающих. Было показано,что добавление глутамина в культуральную среду ока­зывает положительноевлияние на развитие эмбрио­нов многих видов млекопитающих. Однако привведе­нии в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаютсястабильны в условиях культивирова­ния – при температуре 37С многие из нихразруша­ются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладаеттоксическим эффектом.Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработанасреда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержитами­нокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – дажежирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в раз­личныхлабораториях. При том, что роль многих ком­понентов сложных сред до сих порне была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты. CO2-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO3 в воздухе при тем­пературе 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условиясоблюдаются при использовании CO3-инкубаторов, поддерживающихнеобходимую температуру, влаж­ность и уровень CO2 в камере.Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа избаллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды.Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицин­скимстандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая угле­кислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO3-инкубаторов поддержива­ется постояннымиспарением воды со дна камеры ли­бо из специального лотка. Также в некоторыхсовре­менных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух,позволяющая автоматиче­ски поддерживать влажность в камере до 90%.В связи с высоким уровнем влажности в инкубато­рах высок риск роста бактерийи плесени, поэтому не­обходима регулярная очистка всех поверхностей ка­меры.Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать этонадо с большой ос­торожностью, поскольку известно негативное влияниеэтилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе сфоллику­лярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulusoophorus (яйценосный буго­рок) представляет собой часть фолликулярногоэпите­лия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессефолликулогенеза. Помимо прочего фоллику­лярная жидкость содержит фибриноген,что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколь­ко минут послеаспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложнообнару­жить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используютсядва основных подхода:1. Фолликулярную жидкость просматривают под ми­кроскопом сразу послеаспирации и найденные ооци­ты незамедлительно помещают в среду для отмывки.2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду сгепарином, предотвращаю­щую образование кровяных сгустков.Как правило, в большинстве лабораторий руковод­ствуются вторым подходом. Приэтом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 млдобавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрациюгепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин неоказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона.Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательноотмывают в специальной среде.После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает вэмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается наприсутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирокпереливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопомили инвер­тированным микроскопом при небольшом увеличе­нии. Как правило,комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистыекомки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.Найденные ооциты помещаются в среду для отмыв­ки, содержащую HEPES-буфер,позволяющий мани­пулировать с ооцитами на воздухе без риска измене­ния рН вщелочную сторону (такие среды производят­ся большинством фирм,специализирующихся на про­изводстве сред для ЭКО), затем отмываются вкультуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальнуючашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооци­тов икультивирование эмбрионов.Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды,покрытых слоем мине­рального масла, предварительно эквилиброванного скультуральной средой в присутствии 5% С02. Преиму­ществамикультивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральнуюсреду мик­роорганизмов и частичек пыли, возможность культи­вирования внебольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшойконцентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испаре­ния воды ивыхода CO2 из среды вне инкубатора. Одна­ко, если капли со средойпод маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходномуравновесию влажности и концентрации CO2 займет гораздо большевремени, чем в отсутствие масла.Манипуляции с ооцитами проводят с помощью от­тянутых стерильных пастеровскихпипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклян­ных(пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют идругие способы ма­нипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зави­сит отопыта и желания эмбриолога.Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценитьколичество, качество и сте­пень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж
  Ооцит Характеристика
  Очень незрелый Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы во­круг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - за­родышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформи­ровалось
  Незрелый Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло
  Преовуляторный Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано
  Перезрелый Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно
  Лютеинизированный Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желе­образную массу с небольшим количеством клеток
  Дегенеративный Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен
Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, какправило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита.Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточночасто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако болееточное определение степени зрелости (если клетки co­rona radiata и cumulusудаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооци­таи увеличению риска полиспермии при оплодотворении.На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходестимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась послеудаления клеток cumu­lus.
Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенератив­ный ооцит (См. рис. 3)

 

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 513 | Нарушение авторских прав

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)