АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Сопряженные системы

Субстраты и продукты креатинкиназной реакции неразличимы по своим

спектральным характеристикам, и в этой ситуации применяют искусственный

прием — используют системы сопряженных ферментов. «Обратную» креатин-

киназную реакцию дополняют системой гексокиназа (ГК) — глюкозо-6-фосфат-

дегидрогеназа и набором соответствующих субстратов:

КК ADP + Креатинфосфат —→ Креатин + ATP,

ГК ATP + Глюкоза —→ ADP + Глюкозо-6-фосфат,

гл-6-Р-ДГ Глюкозо-6-фосфат + NAD(P) ———→ 6-Р-глюконат + NAD(P)H.

О скорости креатинкиназной реакции судят по приросту поглощения света инкубационной средой при 340 нм, обусловленному накоплением восстановленной формы пиридинового нуклеотида.

Если необходимо изучить особенности протекания «прямой» креатинкиназной реакции, используют сопряженную систему пируваткиназа (ПК) — лактатдегидрогеназа (ЛДГ):

КК ADP + Креатинфосфат —→ Креатин + ATP,

ПК ADP + Фосфоенолпируват —→ ATP + Пируват,

ЛДГ Пируват + NADН —→ Лактат + NAD.

Описанные спектрофотометрические методы достаточно просты и удобны в работе, но серьезную проблему при их использовании представляет наличие примесных активностей, например, примеси аденилаткиназы, которая, взаимодействуя с ADP, может искажать конечный результат наблюдений. И еще одно важное замечание: использование систем сопряженных ферментов в принципе исключает возможность полноценного описания кинетики обратимых процессов, поскольку в таком случае один из продуктов немедленно удаляется из сферы реакции.

1. биолюминесценция

Высокой чувствительностью отличается биолюминесцентный метод, основанный на использовании люциферин-люциферазной системы:

КК ADP + Креатинфосфат —→ Креатин + ATP,

ATP + Люциферин —→ Люцифериладенилат,

Люцифераза Люцифериладенилат + О2 ———→ свечение.

Люциферин светлячков представляет собой карбоновую кислоту, которая активируется в ходе реакции, идущей с участием ATP, и превращается в люцифериладенилат. В присутствии кислорода воздуха и люциферазы люцифериладенилат расщепляется и испускает свечение, интенсивность которого регистри-

руется. Так же, как и в предыдущем случае, наличие примесных активностей сказывается на точности и чувствительности метода.

1. Титриметрия

Запишем уравнение креатинкиназной реакции в ионной форме:

Креатинфосфат2– + ADP3– + H+ ←→ Креатин + ATP4–.

Для поддержания стабильного pH в инкубационную среду необходимо добавлять титрант: щелочь или кислоту — в зависимости от заданного условиями эксперимента преимущественного направления реакции. Расход титранта пропорционален скорости реакции.

Универсален для наблюдения за ходом реакции, т.к. измнение кислотно-основного равновесия есть у многих ферментов. Возможность полноценного описания ферментативных процессов, т. е. возможность одновременного расчета изменяющихся скоростей прямой и обратной реакций в каждом отдельном эксперименте вплоть до момента установления динамического равновесия.

Метод прост в исполнении, легко поддается автоматизации и наиболее экономичен, поскольку набор реагентов минимален: субстраты, препарат исследуемого фермента и титрант. При использовании микроэлектродов объем инкубационной смеси может быть снижен до 100–200 мкл.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 571 | Нарушение авторских прав