АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Метод по реакции с тиобарбитуровой кислотой.

П р и н ц и п. Эритроциты отмываются от белков плазмы и глюкозы; содержащийся в них Гликозилированный гемоглобин гидролизуется нагреванием со щавелевой кислотой, при этом из остатков моносахарида образуется 5-оксиметил-фурфурол, количество которого определяется по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой. Одновременно определяют концентрацию гемоглобина в гемолизате, результаты выражают процентами молекул гемоглобина, которые гликозилированы.

Р е а к т и в ы.

1. Кислота щавелевая,

0,5 моль/л: растворяют 22,5 г Н2СгО4 в 0,5 л воды. Реактив стоек.

2. Кислота щавелевая, 0,2 моль/л: готовят из 0,5 моль/л, смешивая 40 мл реактива 1 и 60 мл воды.

3. Трихлоруксусная кислота, 400 г/л (40%); хранят в холодильнике.

4. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор).

5. Тиобарбитуровая кислота, 50 ммоль/л: растворяют 0,72 г тиобарбитуровой

кислоты примерно в 80 мл воды, доводят рН до 6,0, добавляя 1 н. едкий натр; переливают в мерную колбу и доводят объем водой до 100 мл.

6. Реактивы, необходимые для определения гемоглобина в гемолизате.

7. Калибровочный раствор 5-оксиметилфурфурола: 126мг неокрашенного препарата растворяют в 100 мл 0,25 моль/л раствора щавелевой кислоты; полу-

чается раствор, содержащий 10 ммоль/л. Его разводят в 100 раз тем же раствором щавелевой кислоты; получается раствор с концентрацией 100 мкмоль/л. Из него, путем соответствующего разведения 0,25 моль/л щавелевой кислотой готовят серию калибровочных растворов с концентрациями 12,5—100 мкмоль/л. Хранят в замороженном состоянии при —20 °С. Вместо калибровочного раствора 5-оксиметилфурфурола можно использовать растворы фруктозы, которые готовят точно так же, только для исходного раствора с концентрацией 10 ммоль/л берут 180 мг фруктозы, которые растворяют в 100 мл раствора щавелевой кислоты 0,25 моль/л.

Х о д о п р е д е л е н и я.

Кровь для исследования берут, используя в качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее соли.

1)В 10 мл изотонического раствора хлорида натрия выливают 0,3—0,5 мл цельной крови, перемешивают и центрифугируют.

2)Надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов снова добавляют 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают и снова центрифугируют. Отмытые эритроциты могут храниться в ожидании анализа при —4 °С до 15 дней.

3)Взвесь плотноупакованных эритроцитов в количестве 0,1мл переносят в 1,4мл воды и перемешивают, в растворе определяют гемоглобин любым методом. При этом надо иметь в виду, что концентрация гемоглобина в растворе примерно в 7 раз меньше, чем в цельной крови, т. е. около 20 г/л. Результаты выражают в молях на 1 л.

4)К 1 мл гемолизата добавляют 0,5 мл щавелевой кислоты 0,5 моль/л и закрывают пробирку плотной резиновой пробкой, в которую вставлена тонкая игла для инъекций.

5)Закрытую пробкой пробирку ставят на кипящую водяную баню и через 10 мин вынимают иглу, а плотно закрытую пробирку продолжают нагревать при 100 °С

еще 5 ч.

6)После этого охлаждают в ледяной воде и добавляют I мл охлажденной на льду трихлоруксусной кислоты.

7)Тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при l000g.

8)К 1,5мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают на 30 мин в водяную баню при 40 °С, после этого фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 443 нм против холостого опыта, окраска стабильна на протяжении по крайней мере 2 ч.

На всю серию определений ставят один холостой опыт.

Х о л о с т а я п р о б а:

Для этого смешивают остатки нескольких гемолизатов и из верхнего слоя отбирают 1 мл, в нем проводят гидролиз и осаждение белков трихлоруксусной кислотой; так же как и в опыте, отбирают 1,5 мл надосадочной жидкости, но к ней добавляют вместо раствора тиобарбитуровой кислоты 0,5 мл воды. Смесь инкубируют вместе с пробами 30 мин при 40 °С.

П р и м е ч а н и е. В данном методе после гидролиза и осаждения белков трихлоруксусной кислотой раствор оказывается слегка окрашенным, поэтому вводят специальную холостую пробу. Ее оптическая плотность очень мало варьирует одного гемолизата к другому, поэтому можно ставить только одну пробу на всю серию.

Д л я п о с т р о е н и я к а л и б р о в о ч н о г о г р а ф и к а:

К 1 мл калибровочного раствора, содержащего 5-оксиметилфурфурол в концентрации 12,5— 100 мкмоль/л, добавляют 0,5 мл воды и 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, из пробы отбирают 1,5мл, к которым добавляют 0,5мл раствора тиобарбитуровой кислоты и ставят цветную реакцию, инкубируя на водяной бане при 40 °С в течение 30 мин, так же как и в основном опыте. Калибровочные пробы фотометрируют против холостой калибровочной пробы, в которую вместо калибровочного раствора 5-оксиметилфурфурола берут 1 мл раствора щавелевой кислоты 0,25 моль/л.

Р а с ч е т:

Для выполнения расчета сначала вычисляют содержание гликозилированного гемоглобина в 1 л эритроцитов, для этого содержание 5-оксиметилфурфурола, вычисленное по калибровочному графику, умножают на 15 (разведение

при получении гемолизата). Затем вычисляют содержание гемоглобина в той же эритроцитярной массе, умножая содержание его в гемолизате на 15; чтобы перевести полученный результат в ммоль/л, его делят на 64. Чтобы количество гликозилированного гемоглобина выразить в молярных процентах, его содержание в эритроцитарной массе, выраженное в ммоль/л, делят на содержание гемоглобина в тех же единицах и умножают на 100. Для расчета можно воспользоваться формулой:

где Гли-НЬ — содержание оксиметилфурфурола в гемолизате (ммоль/л); НЬ — содержание гемоглобина в гемолизате (г/л).

Согласно данным автора метода, содержание 5-оксиметилфурфурола в калибровочном растворе может быть рассчитано по формуле:

где Е443 — оптическая плотность при длине волны 443 нм.

Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы.

Содержание гликозилированного гемоглобина, определенное этим методом, 4,5—6,1 молярных %, коэффициент вариации методики, по данным авторов, 5,7 %.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е.

Количество гликозилированного гемоглобина — важный показатель эффективности лечения диабета. Чем ближе к норме его содержание, тем лучше подобрана терапия.

Л и т е р а т у р а.

Standefer J. С., Eaton R. Р. Evolution of colorimetric method for determination

of glycosilated hemoglobin.— Clin. Chem., 1983, № 1, vol. 29, p. 135—137.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 890 | Нарушение авторских прав