АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Основы современной иммунодиагностики

Традиционные методы клинико-иммунологических исследований разделяют на методы оценки клеточного и гуморального иммунитета.

В современной практике клинико-иммунологических исследований основным объектом анализа является кровь – как ее клеточные компоненты, так и сыворотка. В настоящее время в поле внимания иммунологов наряду с мононуклеарной фракцией все чаще оказывается фракция гранулоцитов.

Сегодня иммунологи практически полностью отказались от методов, основанных на розеткообразовании. Это были первые методы, которые позволили определять Т- и В-лимфоциты человека в период, когда отсутствовали необходимые антитела для выявления этих клеток. Число недостатков у этих методов достаточно велико: неоднозначность трактовки результатов (они зависят от условий постановки реакции, качества реагентов, определяются состоянием не только маркерных молекул, но и цитоскелета и др.), трудности, связанные с их стандартизацией и автоматизацией. Проблему определения субпопуляций удалось решить после внедрения проточной цитофлуориметрии и появлением широкого спектра моноклональных антител к маркерным молекулам иммуноцитов.

Цитофлуориметрический анализ может быть представлен следующим образом:

Клетки обрабатываются моноклональными антителами к их мембранным антигенам, коньюгированными флуорохромами. В случае одновременного изучения нескольких маркерных антигенов используют мечение флуорохромами, контрастными по цвету. Клетки, обработанные мечеными антителами, пересекают луч лазера и генерируют различные сигналы (от прямого и бокового светорассеяния и от свечения различных флуорохромов), которые регистрируются и анализируются прибором. Результаты компьютерного анализа выражаются в виде одно- и двухпараметрических гистограмм, отражающих распределение клеток по интенсивности свечения одного или двух флуорохромов. Результаты выражают в процентах меченых клеток и средней интенсивностью свечения. В случае использования двух флуорохромов учитывают процент клеток, меченных каждым типом флуорохрома и обоими красителями одновременно.

Оценка нарушений естественного иммунитета

При лабораторной оценке нарушений естественного иммунитета, как правило, определяют фагоцитарную активность или генерацию метаболически активных радикалов и оценивают состояние системы комплемента.

Хотя определение показателей фагоцитоза (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) с помощью микроскопического подсчета фагоцитирующих клеток и фагоцитированных объектов является методически корректным, существуют модификации метода, позволяющие стандартизировать и автоматизировать регистрацию его результатов. Например, фагоцитоз частиц латекса, меченных флуорохромом, что дает возможность регистрировать результаты цитофлуориметрически.

Широко распространен метод оценки активности фагоцитирующих клеток по восстановлению нитросинего тетразолия. Результаты определения позволяют оценить генерацию формазана по появлению синего окрашивания. Аналогичный результат дают люминесцентные методы регистрации образования метаболически активных форм кислорода и свободных радикалов методами регистрации хемилюминесценции, усиливаемой люминофорами (люминолом и люцигенином).

Ранее состояние системы комплемента оценивали с использованием громоздкой гемолитической системы. В настоящее время стало доступным определение факторов комплемента методом ИФА

Оценка гуморального звена

Определение факторов гуморального иммунитета включает подсчет В-лимфоцитов в периферической крови, определение концентрации иммуноглобулинов основных классов, а в особых случаях субклассов IgG. Адекватными тестами на B-лимфоциты является их цитофлуориметрическое определение с использованием поликлональных антител к общим детерминантам иммуноглобулинов или моноклональных антител к одному из пан-В-клеточных маркеров, чаще всего CD19, 20 или 72. Методом двойной иммунофлуорисценции с использованием антител к CD19 и 5, меченных разными флуорохромами, в специальных случаях определяется субпопуляция В1.

Концентрацию IgM, IgG, IgA, а также типы легких цепей иммуноглобулинов обычно определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, с использованием поликлональных антител. Однако в особых случаях для этого используют иммуноферментные (обычно иммуносорбентные) тест-системы и моноклональные антитела. Изотипы IgG определяют исключительно с помощью иммуноферментных тест-систем и моноклональных антител. Определение IgE проводят радиоиммунным и иммуноферментным методами в рамках аллергологического обследования.

Оценка клеточного звена

Маркеры В-клеток: CD 19+, CD20+, CD 72+

Субпопуляция В1: СD19+CD5+

“Наивные” Т-клетки: CD45RA+

Т-клетки памяти: CD45RO+

Т-хелперы: CD3+CD4+

Индукторы хелперов: CD4+CD29+

Цитотоксические (киллерно-супрессорные) лимфоциты: CD3+CD8+

Индукторы супрессоров: CD4+CD45RO+

Субпопуляция прекиллеров: CD8+CD11b+

Предшественники супрессоров: CD8+Leu7

Классические NK-клетки: CD56+CD57+

БГЛ (субфракция К-клеток): СD16+CD3-

Эффекторы антителзависимой клеточной цитотоксичности (естественные киллеры, обладающие активностью К-киллеров): CD56+CD16+

NKT-клетки (T-лимфоциты с активностью неспецифических киллеров): CD3+CD56+/CD16+

Митогенная стимуляция

В качестве Т-клеточных митогенов применяют фитогемагглютинин (ФГА), реже конканавалин А (КонА).

В качестве В-клеточного митогена – бактериальный липополисахарид.

Для индукции тимусзависимого гуморального ответа (осуществляют В-клетки при участии Т-хелперов) используют митоген лаконоса.

При всех вариантах митогеной стимуляции регистрируется пролиферативный ответ клеток. Выход клеток в цикл и процент клеток, находящихся в фазе S, можно регистрировать методом проточной цитометрии. При этом выявляется содержание в клетках ДНК, оцениваемое по окрашиваемости йодидом пропидия. Формирование пика тетраплоидных клеток означает переход части клеток в S/G2-фазу клеточного цикла. Ответ В-лимфоцитов на митоген лаконоса может регистрироваться также по синтезу иммуноглобулинов различных классов методом ИФА.

Определение цитокинов в биологических жидкостях

Все шире распространяются методы определения цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях (например, ИЛ-1 и ИЛ-6, ФНОα в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите), а также в супернатантах культур стимулированных клеток (моноцитов, макрофагов или лимфоцитов). Этот подход позволяет не только оценить уровень соответствующих цитокинов, он дает возможность сопоставить активность двух типов Т-хелперов – Th1 и Th2, что должно в значительной степени обуславливать тактику иммуномодулирующих воздействий. Для определения Th1- и Th2-лимфоцитов требуются предварительное культивирование в присутствии ИЛ-2 (12-15 сут) и клонирование пролиферических клеток. Предобразованные клетки определяют цитофлуометрически с помощью моноклональных антител к ключевым цитокинам (ИФНγ и ИЛ-4), выявляя эти цитокины в цитоплазме клеток.

Однако определение цитокинов пока дорого, и кроме того имеется существенный недостаток, свойственный большинству функциональных тестов, - необходимость культивирования клеток в стерильных условиях. Методы определения цитокинов в биологических тест-системах (костимуляция тимоцитов, поддержание роста клеточных линий, зависимых от цитокинов) едва ли имеют перспективы практического использования из-за громоздкости и неспецифичности.

Методы оценки антигенспецифического иммунного ответа

in vitro: определение в сыворотке титров естественных изоагглютининов и антител к распространенным микроорганизмам,

in vivo: постановка кожных проб; внутрикожные тесты, которые позволяют выявить ответ организма на гаптены, вызывающие контактную гиперчувствительность (динитрохлорбензол), распространенные антигены (кандидозный антиген, стрептокиназа-стрептодорназа, туберкулин и др.) или митогены (ФГА).

Такие тесты весьма информативны, поскольку отражают реальное состояние клеточного звена иммунной системы, но их недостатком являются инвазивность и временные затраты.

Наиболее важной задачей клинических иммунологов является строгое отношение к трактовке результатов лабораторных иммунологических тестов и отказ от явно устаревших методических подходов, особенно при наличии доступных современных методов.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 451 | Нарушение авторских прав