АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы гибридизации. Основные элементы стратегии и тактики.

Методы гибридизации иммунных спленоцитов с миеломными клетками бывают биологические (с помощью вирусов типа Сендай), химические (с помощью веществ типа лизолецитина или полиэтиленгликоля) и физические (с помощью электрического поля).

Гибридизация с помощью вируса Сендай не всегда дает положительные результаты. Некоторые вторы объясняют это тем, что не все клетки мышиной миеломы имеют рецепторы для данного вируса (Кеннет, 1983).

Поскольку мембраны клеток заряжены и электропроводны, то, понятно, были предприняты попытки, оказавшиеся весьма удачными, вызвать гибридизацию клеток посредством воздействия внешним электрическим или магнитным полем. Эффективность электрогибридизации, как правило, на один – два порядка выше, чем гибридизация биологическими и химическими методами. Технология электрогибридизации позволяет проводить процесс под визуальным контролем через микроскоп и сразу отделять гибридные клетки от неслившихся, что исключает необходимость метаболической селекции. Однако, данный метод требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала. Поэтому наибольшее распространение в настоящее время получили методы гибридизации с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой от 1000 до 6000.

Первое сообщение о том, что ПЭГ повышает частоту слияния прикрепленных клеточных линий сделали Дэвидсон Р. и Геральд П. в 1976 году. В последующем другие исследователи применили этот метод для клеток миеломы и селезенки. При использовании данного метода частота гибридизации составляет обычно один гибрид на каждые 2´10⁵ клеток селезенки. Данная эффективность гибридизации считается вполне удовлетворительной для сильных иммуногенов, но служит серьезным препятствием для слабых иммуногенов. Это хорошо показано в работе Кеннет (1983) в отношении специфичности МАт к 33-галлотипу Н-2в, который является слабым иммуногеном. Автору в своих исследованиях не удалось получить ни одного стабильного гибрида. Поэтому многие исследователи изыскивают методы и способы гибридизации, чтобы повысить частоту образования гибридов, особенно в отношении слабых иммуногенов.

Увеличение частоты образования гибридных клеток пытались решить, изменяя концентрацию ПЭГ, значения рН во время слияния, соотношение селезеночных и миеломных клеток, используя различные партии сывороток и типы питательной среды, тимоциты и другие подкормки, а также разные варианты посева слившихся клеток. Однако, до настоящего времени ни одна из вышеперечисленных попыток, путем манипулирования различных переменных, не привела к существенному повышению абсолютного выхода получаемых гибридов на иммунизированную селезенку. В работах Игнатьевой Г.А. с соавторами, 1989 г., Хаитова с соавторами, 1987 г. и ряда зарубежных авторов описаны различные процедуры гибридизации, которые способствуют получению более легко воспроизводимых результатов. Тем не менее, вопрос о преимуществах той или иной модификации остается открытым.

После гибридизации, через 7-14 дней, в лунках вырастают колонии гибридных клеток и возникает необходимость тестирования супернатантов на наличие специфических антител. В зависимости от целей, поставленных исследователями, тестирование может проводиться различными иммунологическими тестами, в том числе, РТГА, НМФА, РСК, РДП. Однако, многие МАт, в отличие от поликлональных сывороток, активны лишь в некоторых серологических реакциях. Это может быть связано как с эпитопной специфичностью МАт, так и с их изотипом, то есть с антигеннезависимыми свойствами молекул МАт. Поэтому при скрининге предпочтительнее использовать методы, основанные на выявлении непосредственного взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последствий этого взаимодействия (связывание комплемента, агглютинации и т.п.). Наиболее широкое распространение получил иммуноферметный анализ (ИФА), обладающий нанограммовой чувствительностью, максимальной специфичностью и позволяющий обрабатывать сотни проб объемом не более 100 мкл за рабочий день. Реже используется метод иммунофлюорометрического анализа и радиоиммунологического анализа.

Идентифицированные гибридомы клонируют. Следует подчеркнуть, что клонирование является тем этапом гибридомной технологии, который лимитирует пропускную способность всего метода. Поэтому очень важно тщательно провести скрининг, отобрать необходимые гибридомы и, во избежание перерастание антителопродуцирующих клеток клетками, потерявшими способность секретировать антитела, как можно скорее провести клонирование. Широко используется два методических подхода: клонирование методом предельных (лимитирующих) разведений и клонирование в полужидком агаре. В первом случае готовят разведения в ростовой среде, содержащей 1-3 клетки на 0,5 мл и рассаживают по 100 мкл в лунки 96-луночных пластин, либо клетки рассеивают из расчета одна клетка на лунку. При клонировании в полужидком агаре гибридные клетки вносят в 0,5% раствор агара, приготовленный на культуральной среде. Клетки при этом способе обычно вносят в агар из расчета 20-40 клеток на лунку 24-х луночной пластины. Через 7-10 дней образовавшиеся клоны переносят в лунки 96-луночных пластин, контролируя все действия на микроскопе.

Сформировавшуюся популяцию клеток после клонирования тестируют. При первом клонировании гибридом-продуцентов наблюдается расщепление клонов по способности продуцировать специфические антитела. Одной из основных причин нестабильности гибридом считают элиминацию хромосом, несущих иммуноглобулиновые гены. Однако возможны и иные механизмы (как генотипические, так и фенотипические), в силу которых гибридные клетки перестают синтезировать иммуноглобулины. Позитивные клоны после тестирования подвергаются реклонированию. При повторном тестировании количество позитивных клонов может уменьшиться за счет выявления менее стабильных клонов. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. При таком подходе после второго-третьего клонирования число позитивных клонов оказывается близким к 100%. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии необходимо проводить клонирование не реже одного раза в три месяца.

После клонирования гибридные клетки могут быть выращены в культуре в значительном количестве. Как правило, концентрация антител в культуральной жидкости достигает 10-100 мкг/мл. Рост гибридом в организме экспериментальных животных (мышей) обеспечивает продукцию МАт на один-два порядка выше.

Для культивирования гибридных клеток in vivo и для получения асцитической жидкости, содержащей МАт, мышам, предварительно праймированным пристаном (2,6,10,14 – тетраметилпентадекан) или неполным адъювантом Фрейнда, вводят внутрибрюшинно гибридные клетки в дозе 2-4´10⁷ на животное. Асциты формируются на 7-14 сутки после инокуляции клеток. Полученные МАт подвергаются тщательному анализу с целью определения их свойств и дальнейшего практического использования.

Таким образом, технология получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, состоит из множества важных этапов, правильное и качественное выполнение которых обеспечивает успех работы и достижение поставленных целей (схема 1).

На сегодняшний день далеко не все теоретические и технические проблемы создания гибридом решены. Особенно важным является решение вопроса о потери хромосом гибридными клетками.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 494 | Нарушение авторских прав