 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Семей, 2012
СЕМЕЙ МЕМЛЕКЕТТІК МЕДИЦИНА УНИВЕРСИТЕТІ Студенттерге арналған әдістемелік оқу құралы Биологиялық объектілерді микроскоптаудың арнайы амалдары
Құрастырған: Кусаинова К.Т.
Семей, 2012 1.Тақырып: Биологиялық объектілерді микроскоптаудың арнайы амалдары. 2. Мақсаты: Молекулалық диагностиканың, зерттеудің клиникалық- зертханалық және функционалдық әдістерінің, медициналық зерттеулерде қазіргі заманғы техникалық құрал- жабдықтарды қолданудың теориялық негіздері болып табылатын дүниеге көзқарасты және медицинадағы ғылыми методологияны қалыптастыру. Биологиялық объектілерді микроскоптаудың арнайы амалдары Студенттерді микроскоптаудың арнайы амалдарымен таныстыру. 3. Оқыту мақсаттары: Микроскоптяның арнайы тәсілдерін айқындап, микроскоптың көмегімен кіші объектілердің өлшемдерін анықтай білу. студенттердің логикалық ойлауын, дәйекті ой- пікір мен тұжырымды дұрыс құра білуді қалыптастыру. Білу керек: Микроскоптың құрылысы Микроскоптың оптикалық жүйесі Окуляр микрометр Істей алуға тиіс Микроскоппен жұмыс істеу Құралдың негізгі өлшеуіш шкаласымен жұмыс істеу Окуляр микрометрдің бөлік құнын анықтау Өлшеу нәтижесін қорытындылау 4. Тақырыптың негізгі сұрақтары: Микроскоптың құрылысы Ажырату қабілеттігі Ажырату шегі Объектив және окуляр Микроскоптың оптикалық жүйесі Биологиялық объектілерді микроскоптаудың арнайы амалдары.
Ақпараттық- дидактикалық блок Микроскопия- (лат. микро- ұсақ, кішкентай және грекше skopeo- көремін)- микроскоптың көмегімен көзге көрінбейтін ұсақ объектілерді оқып- зерттеу әдісі. Микроскопия бактериологиялық, гистологиялық, цитологиялық, гематологиялық және т.б. зерттеулерде кең қолданылады. Микроскопия бірнеше түрге бөлінеді: оптикалық, электрондық, көпфотонды, рентгенді микроскопия және т.б. Микроскопия әдістері зерттелетін объектінің сипатына, қасиеттеріне қарай таңдалады. Өйткені олар кескіннің контрастылығына әсер етеді. Жарық микроскопиясынан басқа фазалық- контрасты, қараңғы өрісті (ультрамикроскопия), люминесцентті, поляризациялық, ультракүлгін және электрондық микроскопия бар. Микроскоппен объектілердің негізгі екі тобы зерттеледі: 1) мөлдір; 2) мөлдір емес. Осы топтарға сәйкес өтетін және щағылған жарық үшін арнайы жарықтандырғыш қондырғылары жасалады. Микроскопиялық зерттеулерде объектілерді жарық өрісті және қараңғы өрісті жарықтандыру кең таралған. Жарық өрісті әдіс объектіні жарықтандырғыш жүйесінен шыққан жарықпен сәулелендіріп, жарықтың объектіден өтіп (өтетін жарық) немесе объектінің бетінен шағылып (шағылған жарық), объектив саңылауына түсіп, объектінің мөлдір емес элементтерінің жарық фонда қара кескінін алуға негізделген. Қараңғы өріс әдісі көбінесе шағылған жарық арқылы (объектінің біртекті емес элементтерінен) кескінді алуға негізделген. Жарық өрісті әдіс және оның түрлері Жарық микроскопия әдісі (жарықтандыру және бақылау) зерттелетін объектіні жарықтандыру тәсілі бойынша бөлінеді: өтетін жарықтағы және шағылған жарықтағы жарық өрісті әдіс (мөлдір емес объектілер үшін қырынан (бүйірден) жарықтату). Осы әдістерді ұнтақтарды, суспензияларды, эмульсияларды, көбіктерді- пена) дисперсиялық талдауда қолданады. Осы әдісте кескіннің контрастылығы жарықтың жұтылуымен анықталады. Жарық өрісті әдістің түрлері: 1) Өтетін жарықтағы жарық өріс әдісі абсорбцияланатын (жарықты жұтатын) бөлшектері, бөліктері бар мөлдір препараттарды зерттеуде қолданылады. Мысалы, өсімдік пен жануарлар тінінің жіңішке боялған кесіктері. Препарат болмаған жағдайда конденсордан шыққан жарық шоғыры объектив арқылы өтіп, окулярдың фокус жазықтығы жанында бірқалыпты жарықталған өрісті береді. Препаратта абсорбциялайтын элемент болған жағдайда жарықтандырғыш жүйеден түскен жарық біршама жұтылып, біршама шашырап, нәтижесінде кескін пайда болады. Түскен жарықтың едәуір бөлігі объективке түспей, абсорбцияламайтын объектілер оларды күштірек шашыратқан жағдайда жарық өрісті әдісті қолдануға болады. Осы әдісте жарықтандырғыш пен конденсор дене үстелінен төмен қойылады. 2) Бүйірден жарықтандыру әдісі - жарық өрісті әдістің бір түрі. Осы әдістің алдыңғы әдістен айырмашылығы, бақылайтын бағытқа үлкен бұрышпен жарықты объектіге бағыттайды. Кейде осы әдіс көлеңкелердің пайда болуы салдарынан объектінің «рельефтілігін» анықтауға көмектеседі. 3) Шағылған жарықтағы жарық өріс әдісі жарықты шағылдыратын мөлдір емес объектілерді зерттеуде қолданылады. Препарат объектив арқылы жоғарыдан жарықтандырылады (жарықтандырғыш және жартылай мөлдір айна). Объектив осы жағдайда конденсор ролін атқарады. Объективпен және тубусты линзамен жазықтықта пайда болған кескіндегі препарат құрылымы оның элементтерінің шағылдырғыш қабілетінің әртүрлігі арқасында көрінеді; жарық өрісте түскен жарықты шағылдыратын препараттың біртекті емес бөліктері айқын көрінеді. Қараңғы өріс әдісі
Қараңғы өрісті микроскопия кезінде объектілер қараңғы фонда жарқырап көрінеді. Бірақ бұл әдіс тек объектінің контурын ғана көруге мүмкіндік береді, ал объектінің ішкі құрылымын зерттеуге мүмкіндік бермейді. Қараңғы өрісті әдіс үшін аса қуатты жарықтандырғыш және лампаның максимал қызуын қолданады. Қараңғы өріс кезінде кескін препараттың құрылымдық элементтерінен шағылған жарық арқылы пайда болады. Қараңғы өрісті әдістің түрлері: 1) Өтетін жарықтағы қараңғы өріс әдісі жарық өрісімен көрінбейтін, жарықты жұтпайтын мөлдір объектілердің кескінін алу үшін қолданады. Биообъектілер жиі осындай түрде кездеседі. Жарық жарықтандырғыш пен айнадан конденсор арқылы препаратқа бағытталады. Конденсордан шыққанда мөлдір препарат арқылы өткен, бағытын өзгертпеген жарықтың көп бөлігі қуысты конус тәрізді шоғыр түзіп, объективке түспейді (осы конустың ішіндегі жарық сәулелері). Микроскопта кескін препараттың ұсақ бөлшектерімен конустың ішіне біраз шағылған және объектив арқылы өткен сәулелермен жасалады. Қараңғы фонда көрінетін аймақта препарат құрылымындағы қоршаған ортаның сыну көрсеткішінен айырмашылығы бар элементтердің ақшыл кескіндері көрінеді. Ал ірі бөлшектердің кескінінде жарық сәулесін шашыратқан тек ақшыл шеттері ғана көрінеді. Осы әдісті қолдана отырып, кескіннің түрі бойынша бөлшектердің мөлдір, мөлдір еместігін анықтауға мүмкін болмайды. 2) Шағылған жарықтағы қараңғы өріс әдісі Осы әдісте мөлдір емес препараттар зерттеледі. Алынатын кескін объектіден шағылған сәулелер арқылы ғана пайда болады. Фазалық- контрасты әдіс Фазалық- контрасты әдіс- жарық өрісті әдіспен көрінбейтін, мөлдір және түссіз, боялмаған объектілердің кескінін алуға арналған әдіс. Осындай объектілерге мысалы, жануарлардың боялмаған тірі тіндері жатады. Осы әдістің мәні мынада: препараттың түрлі элементтерінің сыну көрсеткіштерінің өте аз айырмашылықтары кезінде осы элементтер арқылы өткен жарық толқыны әртүрлі фазалық өзгерістерге ұшырайды (фазалық рельеф түзіледі). Көзбен, фотопластинкамен бақыланбайтын осы фазалық өзгерістер арнайы оптикалық қондырғылардың көмегімен жарық толқынының амплитудасының өзгерісіне түрленеді, яғни жарықтылық өзгереді («амплитудалық рельеф»), осы өзгерістерді енді көзбен ажыратып, көруге болады. Басқаша айтқанда, осылай алынған көрінетін кескінде жарықтылықтың (амплитудалардың) үлестірілуі фазалық рельефті қайта береді. Осылайша алынған кескін фазалық- контрасты деп аталады. Фазалық- контрасты қондырғы кезкелген жарық микроскопына орнатылуы мүмкін.
1. Арнайы фазалық пластинкалары бар объективтер жиынтығы; 2. Бұрылатын дискісі бар конденсор. Онда әр объективтегі фазалық пластинкаға сәйкес келетін сақиналы диафрагмалар орнатылған; 3. Фазалық- контрастылықты баптауға арналған қосымша телескоп. Микроскопияның осы әдісін қолданудың арқасында боялмаған тірі микроағзалардың контрастылығы кенет артады, жарық фонда қараңғы немесе қараңғы фонда жарық болып көрінеді. Фазалық-контрасты микроскопия тіндердің жасушаларын оқып- зерттеуде, жасушаларға әртүрлі вирустардың әсерін бақылау және т.б. үшін қолданылады. Осындай жағдайда оптикасы керісінше орнатылған биологиялық микроскоптар жиі қолданылады (инвертированные). Осындай микроскоптарда объективтер төменде, конденсор жоғарыда орналасады. Фазалық- контрасты микроскопия жарықтың интерференциясына негізделген: қоршаған ортаның сыну көрсеткішінен айырмашылығы бар мөлдір объектілер ақшыл фонда қара болып көрінеді (позитивті фазалық контраст) немесе қараңғы фонда ақшыл болып көрінеді (негативті фазалық контраст). Поляризациялық микроскопия
Поляризацияланған сәулелермен өтетін және шағылысқан жарықта зерттеу әдісі сәулені қосарланып сындыру немесе шағылыстырғыш қасиеті бар анизотропты объектілер үшін қолданылады. Осындай объектілдерге көптеген минералдар, кейбір жануарлар мен өсімдіктердің тіндері мен жасушалары, табиғи және жасанды талшықтар жатады. Анизотропты препараттарды зерттеу кезінде микроскоптың кәдімгі схемасына жарықтандырғыш жүйенің алдына поляризатор орнатады, ал объективтен кейін анализатор орнатылады. Жарықтандырғыш сәулелендірген жарықты поляризатор арқылы өткізеді. Осы кезде жарыққа берілген поляризация препарат арқылы жарықтың өтуі кезінде өзгереді (немесе препараттан шағылғанда). Осы өзгерістер анализатордың және әртүрлі оптикалық компенсаторлардың (қозғалмайтын және қозғалатын кристалл пластинкалар т.б.) көмегімен оқып- зерттеледі. Осы өзгерістерді талдай келе, анизотропты микрообъектілердің негізгі оптикалық сипаттамалары жайында айтуға болады: сәуленің қосарланып сыну күші, оптикалық осьтердің саны және олардың бағыты, поляризация жазықтығының айналуы, дихроизм. Поляризатор мен анализатор өзара параллель не кесе көлденең орнатылады. Кесе көлденең орнатылған жағдайда микроскоптың көрінетін қараңғы аймағында объектінің қара, ақшыл не боялған анизотропты элементтері көрінеді. Осы элементтердің түрі объектінің поляризация жазықтығына қатысты орналасуына және сәуленің қосарланып сыну шамасына байланысты. Интерференциялық контраст әдісі (интерференциялық микроскопия).
Ультракүлгінді микроскопия (УКМ) кейбір заттардың (ДНҚ, РНҚ) ультракүлгін сәулелерді жұту қабілетіне негізделген. Осы әдіс арнайы бояғыш әдістерсіз-ақ аталған заттарды бақылауға, олардың жасушадағы таралын сандық анықтауға мүмкіндік береді. УК микроскоптарда УК сәулелерді өткізетін кварцты оптика қолданылады. Люминесцентті жарықта зерттеу әдісі Флуоресцентті (люминесцентті) микроскопия кейбір заттардың люминесценциялау қабілетіне негізделген, яғни көрінбейтін УК не көк жарықпен жарықтандырғанда жарқырауына негізделген. Люминесценция түсі оны қоздырушы жарықпен салыстырғанда спектрдің аса ұзын толқынды бөлігіне қарай ығысқан. Люминесценцияны көк жарықпен қоздырған кезде оның түсі жасылдан қызылға дейін болуы мүмкін, ал егер люминесценцияУК сәулемен қоздырылатын болса, онда жарқырау көрінетін спектрдің кезкелген аймағында болуы мүмкін. Люминесценцияның осы ерекшелігі қоздырушы жарықты жұтатын арнайы жарық сүзгіштерді пайдаланып, әлсіз люминесцентті жарқырауды байқауға мүмкіндік береді. Люминесцентті жарықта зерттеу әдісі (люминесцентті микроскопия немесе флуоресцентті микроскопия) микрообъектілердің микроскоппен қарағанда жасыл- қызыл сары (оранжевый) түсті жарық шығаруын бақылауға негізделген. Осындай түсте жарық шығару объектіні көк- күлгін түсті не УК сәулемен жарықтандыру кезінде пайда болады. Микроскоптың оптикалық жүйесіне осы кезде екі жарық сүзгіш орнатылады. Олардың бірін конденсордың алдына орнатады. Осы жарық сүзгіш жарықтандырғыш көзінен шыққан, объектінің өзінің люминесценциясын қоздыратын (меншікті люминесценция) не препаратқа енгізілген және препараттың бөлшектерімен жұтылған арнайы бояғыштардың люминесценциясын (екінші ретті люминесценция) тудыратын толқын ұзындықтағы сәулелерді ғана өткізеді. Объективтен кейін орнатылатын екінші жарық сүзгіш бақылаушы көзіне тек люминесценция жарығын ғана өткізеді. Люминесцентті микроскопияда препараттарды жарықтандыру жоғарыдан да (объектив арқылы да), кәдімгі конденсор арқылы төменнен де жүргізіледі. Жоғарыдан жарықтандыру арқылы бақылау кейде «шағылған жарықтағы люминесцентті микроскопия» деп аталады. Осы әдіс микробиологияда, вирусологияда, гистологияда, цитологияда, тамақ өнеркәсібінде, топырақты зерттеуде, микрохимиялық анализде, дефектоскопияда кең түрде қолданылады. Осындай алуан түрлі қолданылуы көздің түстерге деген аса жоғары сезімталдығымен, люминесценцияланбайтын қараңғы фонда өздігінен жарқырайтын объектінің кескінінің жоғары контрастылығымен түсіндіріледі. Сонымен қатар люминесцентті сәуленің интенсивтілігі мен спектрлік құрамын біле отырып, зерттелетін заттардың құрамы, қасиеттері жайында құнды мәліметтер алуға болады.Микроағзалардыңкөпшілігінің меншікті люминесценциясы болмайтындықтан, флуоресцентті микроскопта бақылау үшін оларды өңдеудің бірнеше тәсілі бар. Ең алдымен ондай тәсіл- флуорохромдау. Флуорохромдау- флуоресценциялайтын бояғыштардың (флуорохром) күшті ерітінділерімен бояу. Ультрамикроскопия әдісі Ультрамикроскопия әдісінің негізі- ультрамикроскоптарда препараттар бақылау бағытына перпендикуляр бағытта жарықтандырылады. Осы әдісте өлшемдері аса күшті микроскоптардың ажырату қабілеттігінің шегінен аса алыста жататын өте кіші бөлшектерді табуға (бірақ бақылауға емес) болады. Иммерсиялық ультрамикроскоптардың көмегімен препаратта өлшемдері 2×10-9 м-ге дейінгі бөлшектерді тіркей алуға болады. Бірақ осындай бөлшектердің пішіні мен нақты өлшемдерін осы әдіс арқылы анықтау мүмкін емес. Олардың кескіні бақылаушыға дифракциялық дақ түрінде көрінеді, дақтардың өлшемдері бөлшектердің пішіндері мен өлшемдеріне байланысты емес, ол объективтің апертурасы мен микроскоптың ұлғайтуына байланысты. Осындай бөлшектер жарықты өте аз шағылдыратын болғандықтан оларды жарықтандыру үшін аса күшті жарық көзі қажет болады. Ультрамикроскоптар негізінен коллоидты химияда қолданылады. Электрондық микроскопия Электрондық микроскопия жарық микроскопиясынан электрондық микроскоптың құрылысы мен мүмкіндіктері бойынша ерекшеленеді. Электрондық микроскопта кескін алу үшін жарық сәулелерінің орнына терең вакуумдегі электрондар ағыны қолданылады. Электрондарды фокустайтын линзалардың орнына электромагниттік катушкалармен жасалатын магнит өрісі қолданылады. Электрондық микроскоптағы кескінді флюоресцентті экранда бақылап, суретке түсіріп алады. Зерттелетін объектілер ретінде қалыңдығы 20-50 нм болатын микроағзалардың ультра жіңішке кесіктері алынады. Қазіргі заманғы электрондық микроскоптардың жоғары ажырату қабілеттігі пайдалы ұлғайтуды миллион есе алуға мүмкіндік береді. Электрондық микроскоптың көмегімен тіндер мен микроағзалардың ультра жіңішке құрылымын оқып- зерттейді, иммундық электрондық микроскопия жүргізіледі. Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 3631 | Нарушение авторских прав |
Бұл әдіс микроскопиялық объектілердің жарықты шашырату қабілетіне негізделген. Қараңғы өрісті микроскопия үшін кәдімгі объектив пен арнайы қараңғы өрісті конденсорларды қолданады. Қараңғы өрісті конденсорлардың басты ерекшелігі- конденсорлардың ортаңғы бөлігі қара түсті болады және жарықтандырғыштан келген тура сәулелер микроскоптың объективіне түспейді. Қараңғы өрісті микроскопияда объектіні бүйірден сәулелендіргенде одан шағылған сәулелер ғана объективке түседі. Қараңғы өрісті микроскопия Тиндаль эффектісіне негізделген, оның белгілі бір мысалы, жіңішке жарық сәулесі түскенде ауадағы шаңдардың көрінуі. Жарықтандырғыштан тура сәулелер объективке түспеу үшін, объективтің апертурасы конденсордың апертурасынан кіші болу керек. Апертураны азайту үшін кәдімгі объективке диафрагма орнатады.
Фазалық- контрасты қондырғы мынадай бөліктерден тұрады:
Поляризациялық микроскопия-оптикалық анизотропты элементтері бар (немесе тұтастай осындай элементтерден тұратын) препараттарды микроскопиялық зерттеу үшін поляризациялық жарықта бақылау әдісі. Көптеген минералдар, кейбір жануарлар мен өсімдіктер тіндері осындай препараттарға жатады. Анизотропты микрообъектілердің оптикалық қасиеттері әртүрлі бағыттарда түрліше болады және бақылайтын бағытқа, түскен жарықтың поляризация жазықтығына қатысты осы микрообъектілердің бағытталуына байланысты микрообъектілердің қасиеттері де түрліше білінеді. Бақылауды өтетін жарықта да, шағылған жарықта да жүргізуге болады.
Интерференциялық контраст әдісінің мәні: микроскопқа енген кезде әр сәуле екіге жіктеледі. Осы сәуленің бірі бақыланатын бөлшек арқылы өтеді, ал екіншісі- бөлшектің жанынан микроскоптың оптикалық тармағы бойымен не қосымша тармақ бойымен өтеді. Микроскоптың окулярлық бөлігінде екі сәуле қайтадан қосылып, өзара интерференцияланады. Сәуленің бірі объект арқылы өтіп, фаза бойынша кешігеді (оның 2-ші сәулемен салыстырғанда жол айырмашылығы болады).Осы кешігудің шамасы компенсатормен өлшенеді. Интерференциялық контраст әдісі фазалық- контрастылық әдіске ұқсас деп айтуға болады, өйткені осы екі әдіс те микробөлшек арқылы және оның жанынан өткен сәулелердің интерференциясына негізделген. Фазалық- контрастылық микроскопия сияқты интерференциялық контраст әдісі де мөлдір, түссіз объектілерді бақылауға мүмкіндік береді, бірақ олардың кескіні әр түсті де болуы мүмкін (интерференциялық түстер). Осы екі әдіс те тірі тіндер мен жасушаларды оқып- зерттеуге жарамды және көптеген жағдайларда осы мақсатта қолданылады. Интерференциялық микроскопияның фазалық- контрастылық микроскопия әдісінен басты айырмашылығы- микрообъектілермен жасалған сәулелердің жол айырмасын өлшеудің мүмкіндігі. Интерференциялық контраст әдісі микроскопияның басқа әдістерімен бірлесе жүргізіледі, әсіресе поляризациялық жарықта бақылау әдісімен. Осы әдістің ультракүлгін сәулелер микроскопиясымен үйлестірілуі мысалы, объектінің жалпы құрғақ массасындағы нуклеин қышқылының мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді.