АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

идентификации микроорганизмов (вопрос 18)

В естественных условиях микроорганизмы существуют в смешанных популяциях, ассоциациях и пр. Для установления этиологического фактора инфекционного заболевания бактериологическим методом, требуется выделение микроба в чистом виде. Для этого применяют различные питательные среды из перечисленных выше групп (транспортные, обогащения, элективно-диагностические, дифферернциально-диагностические и пр.) в определенном порядке.

Вначале делают посев исследуемого материала (кровь, фекалии, моча, соскобы розеол, мокрота, носоглоточные смывы и пр.) после определенной его обработки как обычно на среды обогащения и элективно-диагностические (при необходимости перемещения посевов на большие расстояния применяют среды консервирования). Засеянные питательные среды выдерживают при температуре, оптимальной для данного микроба (обычно в термостате при 37⁰ С).

После экспозиции просматривают чашки Петри и выбирают подозрительные колонии (по цвету, форме, размеру, краям колонии и пр. - это диагностические признаки), которые пересевают на скошенный агар, с целью получения чистой культуры в достаточном для дальнейшей работы количестве. Со скошенного агара делают пересев на дифференциально- диагностические среды.

При исследовании на энтеробактерии вводят дополнительные элективные среды (Олькеницкого и пр.), откуда делают пересевы на дифференциально-диагностические среды, с целью определения свойств выделенной культуры: ферментативных, протеолитических, бродильных, токсигенных и других, что является основой в определении вида, подвида и др. качеств исследуемой культуры.

Такая схема выделения микроба и идентификации может длиться 3-4 дня или более в зависимости от вида микроба (свойств). Конечным результатом является выделение штамма и установление его вида, а возможно – серовара, фаговара, антибиотикочувствительности и пр., т.е. проводится не только постановка этиологического диагноза, но и даются некоторые рекомендации для лечения конкретных инфекционных больных.

Чистая культура - это потомство одной микробной клетки, выращенное на питательной среде, т.е. культура моноклона.

Штамм - это чистая культура определенного вида микроба, выделенная в данное время из конкретного материала.

Вид – это категория, обозначающая микроорганизмы, имеющие сходный генотип и несколько различающиеся по фенотипу.

Род - это собирательный термин, обозначающий сходные по генотипу и несколько различающиеся по фенотипу (свойствам) микроорганизмы нескольких видов.

Для культивирования микроорганизмов необходимы не только питательные среды, но и условия изоляции пассируемых микробов от загрязнения.

Это достигается стерильными условиями культивирования.

Посев инокулята

В бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. Для конечного результата является очень важным: как и в какие сроки был взят материал для исследования и где он был засеян (у постели больного или в лаборатории).

Если материал перевозят в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

Для каждой инфекции существует инструктивно-методическая литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

Первым этапом бактериологических исследований является посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащения. Питательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

Посев проводят петлей (материал наносят у края чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал наносят на поверхность агара, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом вносят в чашку, делают площадку и круговыми движениями чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

Для разных целей посевы, например, делают штрихами. Карандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от края чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиваться (обычный посев). Иногда делают посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура) наносят пипеткой на агар и тщательно распределяют по всей поверхности, покачивая чашку. Надписи делают на чашках со стороны дна.

При пересеве из пробирки в чашку Петри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти. Петлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. Пробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжигая края пробирок. Вводят петлю внутрь пробирки, прикасаются к краю питательной среды для охлаждения петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не повреждая агар.

Затем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и ставят ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, вводят внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втирая материал, а затем, поворачивая чашку, засевают штрихами по секторам чашки. Петлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и ставят в штатив.

При посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. Петлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. Петлю вводят в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, вводят в другую пробирку и производят посев штрихами от нижнего края косяка к верхнему.

Если засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое время в этой среде, чтобы культура могла распределиться в жидкости.

При посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. Затем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и ставят в штатив, а затем ставят и пробирки.

При посеве на скошенный агар, делают штрихи, начиная с нижнего края скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). При посеве на среды Ресселя, Олькеницкого и Клиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

При посеве жидкого материала пользуются пипетками или петлей. При посеве пробы для количественного учета микроорганизмов наносят 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожигая шпатель, переносят его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Лишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С (обычно) или при температуре, оптимальной для культуры. Срок инкубации зависит от скорости деления клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

Изучение изолированных колоний

По истечение определенного срока на засеянных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

Колония - это видимое невооруженным глазом характерное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засеянных микробных клеток.

Это второй этап бактериологического анализа. Морфология выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак. Колонии микробов изучают в проходящем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. Рассматривают чашку со стороны дна.

Оценивают морфологию по определенным критериям:

n размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

n форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

n профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

n характер поверхности (гладкая, шероховатая, морщинистая, изрезанная и пр.),

n прозрачность колонии (прозрачная, мутная, полупрозрачная),

n пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

n структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и пр.),

n края колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

n консистенция колонии (мягкая, сухая, слизистая, сметанообразная, крошковидная),

тип колонии (круглые, влажные, выпуклые – S-тип, сухие, шероховатые, края неправильные – R-тип, тягучие, слизистые, валик вокруг колонии – М-тип)

(вопрос 19)

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты - специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов.

1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.

2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов.

3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

- конститутивные, синтез которых происходит постоянно;

- индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;

- репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.

Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительно- восстановительные.

5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

(вопрос 15)

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих- анаболизм и катаболизм. Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм- энергетический обмен, связан с окислительно- восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот)- осмотрофы, или в виде отдельных частиц- фаготрофы.

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: - пассивная диффузия - по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

- облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;

- активный транспорт- против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

- транслокация (перенос групп)- против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементы- органогены, необходимые для синтеза органичеких соединений- углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза- например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно- восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические- органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

(вопрос 16)

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О₂), при анаэробном- связанный кислород (-NO₃, =SO₄, =SO₃).

Примеры.

О₂

Аэробное дыхание донор водорода H₂O

Анаэробное дыхание

нитратное окисление NO₃

(факультативные анаэробы) донор водорода N₂

сульфатное окисление SO₄

(облигатные анаэробы) донор водорода H₂S

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1. Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO₂, например до 10- процентной концентрации.

3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4. Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H₂O₂- перекись водорода, -О₂ - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH₂).

(вопрос 3)

Прокариоты отличаются от эукариот по ряду основных признаков.

1.Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны).

2.Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.

3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.

4.Неспособность к эндоцитозу (захвату частиц пищи).

5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.

6. Значительно меньшие размеры (как правило). Большая часть бактерий имеет размеры 0,5- 0,8 микрометров (мкм) х 2- 3 мкм.

(вопрос 17)

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N₂- 85%, CO₂- 10%, H₂- 5%).

2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологический- совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный- используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов- очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно- восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий- анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

(вопрос 20)??? и 21???

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1349 | Нарушение авторских прав