 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Тема занятия: «Микробиологическая диагностика дифтерии»Практическая работа №49 Тема занятия: «Микробиологическая диагностика дифтерии» Составила преподаватель: Якимова Л. М.
Минск
Практическая работа №49 Тема занятия: «Микробиологическая диагностика дифтерии» Цель занятия: отработать методику микробиологической диагностики дифтерии. Самостоятельная работа:
5.Постановка пробы на токсигенность
І этап микробиологической диагностики дифтерии При дифтерии зева и носа в качестве исследуемого материала используют слизь и пленки с миндалин зева и носа, при дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, влагалище) помимо поврежденных участков следует также брать материал с миндалин и из носа. Для забора материала используют сухие стерильные ватные тампоны. Материал с миндалин и носа берут отдельными тампонами натощак и не ранее, чем через 2 часа после еды при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют 1 тампон, который вводят сначала в один, а затем - в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи. При применении АБ и других химиотерапевтических средств следует брать материал не ранее, чем через 3 дня после окончания лечения. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не познее 3 часов после взятия материала. В отдаленных от баклаборатории районах материал рекомендуется засеять на чашки или использовать транспортную среду (5мл 0,1% агара+0,5мл сыворотки+0,05мл 2% К2ТeO3) – тампон опускают в пробирку со средой, это удлиняет срок выдачи результата на 1 сутки. При транспортировке на дальние расстояния можно использовать тампоны, смоченные 5% раствором глицерина на физ. растворе (доводят рН до 7,6 с помощью 20% раствора Na2HPO3). Тампон опускают в глицерин, отжимают о стенки флакона и стерилизуют в автоклаве при Т=1120 – 30 минут. Пробирки четко маркируют, указывая зев(з) и нос(н), скрепляют вместе от каждого лица и придают номер в соответствии с прилагаемым списком, где указывают ФИО, происхождение материала (зев, нос или другая локализация), название учреждения, направляющего материал, или дом. адрес, цель обследования (диагностическая, по эпидпоказаниям, профилактическая и пр.), время взятия материала. І этап обследования: проводят посев на селективные среды (КТА, среда Клауберга, хинозольная среда Бучина, среда Хойла) и неселективные среды (КА), согретые при комнатной температуре или в термостате 15-20 минут. Посев от одного лица производят на одну чашку (отдельно засевают зев и нос на половину чашки). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку. Техника посева: материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2*1см, затем одной стороной стерильной петли делают 30-40 штрихов на I сектор, после чего второй стороной петли 30-40 штрихов на II сектор, после стерилизации петли 30-40 штрихов одной стороной петли на III сектор и далее второй стороной петли 30-40 штрихов на IV сектор. Рецепт приготовления КТА: к 100мл 2% агара, расплавленного и охлажденного до 500,добавляют 2мл 2% раствора теллурита калия, 10-15 мл гемолизированной крови (10 мл дефибринированной крови + 2 мл стерильной дистиллированной воды) и разливают. Рецепт приготовления среды Клауберга: к 100мл 3% агара, расплавленного и охлажденного до 500, добавляют 3мл 2% раствора теллурита калия, 10мл глицериновой смеси и 50мл лаковой крови (34 мл стерильной дистиллированной воды + 16 мл дефибринированной крови). Все быстро перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина. Глицериновую смесь готовят за 1,5 месяца, смешивая 20мл бараньей или лошадиной крови с 10мл химически чистого глицерина. Хинозольная среда Бучина, среда Хойла готовятся согласно прописи на этикетке. ІІ этап микробиологической диагностики дифтерии: Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева с помощью МБС. На КТА через 24 часа колонии возбудителя дифтерии светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями, вязкие, через 48 часов – серые с металлическим оттенком с ровными или слегка изрезанными краями, вязкие или ломкие, напоминают перевернутую сковородку, часто плотные и при прикосновении петлей колятся. На среде Бучина колонии возбудителя дифтерии имеют синий цвет с различными оттенками от серовато-зеленоватого до фиолетового, а среда на месте их роста приобретает фиолетовый оттенок. Дифтероиды на этой среде дают бесцветные колонии, а ложнодифтерийные палочки – колонии голубоватого цвета. На среде Клауберга биовар гравис дает радиально-исчерченные с волнистым краем шероховатые колонии серого или черного цвета, плоские, морщинистые с приподнятым центром (2-3мм), а биовар митис – гладкие, темные, выпуклые (1-2мм) колонии с зоной гемолиза. Тип интермедиус растет в виде мелких, плоских колоний с неровными краями, темно-серого или коричневого цвета с черным центром (0,5-1мм), встречаются крайне редко. На КА колонии средней величины серовато-белого цвета. Из подозрительных колоний мазки можно не делать, но из сомнительных колоний мазки делают и красят их по Леффлеру или Нейссеру. В мазках со сред с теллуритом калия и хинолонами коринебактерии дифтерии могут быть утолщены, укорочены, но характерны расположение и полиморфизм. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем МБС снимают на 25% скошенный сывороточный агар для накопления чистой культуры, на среду Пизу (проба на цистиназу), из другой части колонии ставят пробу на токсигенность. Постановка пробы на токсигенность: в чашки Петри разливают среду для определения токсигенности (ОТДМ с 20% сыворотки). На середину поверхности застывшего агара обожженным пинцетом накладывают фильтровальную бумажку 1,5x8см, предварительно смоченную противодифтерийной антитоксической сывороткой. Чашки подсушивают в термостате при Т=370 15-20 минут, повернув их вверх дном. Испытуемую культуру засевают бляшками (диаметр бляшек 0,8-1,0 мм), расстояние от краев полоски фильтровальной бумаги до ряда бляшек 0,5-0,7см. Бляшки испытуемой культуры засевают между бляшками заведомо токсигенного (контрольного) штамма таким образом, чтобы расстояние между бляшками составляло 0,7-0,8см. Для точного выполнения данных расстояний при постановке пробы на токсигенность следует использовать заранее заготовленные трафареты, которые подкладывают перед началом работы под донышко чашки Петри с питательной средой. Подготовительная работа: подготовка фильтровальных бумажек и разведение сыворотки. Полоски фильтровальной бумаги 1,5x8см заворачивают по 2-4 шт. в пакетик и стерилизуют при 1200 30 минут в автоклаве. Эти пакетики можно хранить в стерильной чашке Петри до 3-х недель. Смачивание фильтровальной бумажки противодифтерийной сывороткой проводят в стерильной чашке Петри. Для этого их переносят стерильным пинцетом из пакетика в стерильную чашку Петри и на одну бумажку наносят 0,25мл сыворотки, содержащей 500МЕ в 1мл. Смоченную противодифтерийной сывороткой бумажку при переносе на чашку слегка встряхивают или прикладывают к стерильной крышке чашки Петри с целью убрать излишки сыворотки. Разведение сыворотки: сыворотку из ампулы переливают в стерильную пробирку (на пробирку наносят все данные упаковки с указанием срока хранения в холодильнике). Сыворотка может содержать различное содержание МЕ в ампуле (500МЕ, 10000МЕ, 20000МЕ) и в разных объемах (указано на этикетке). Пример разведения: 10000МЕ в 4,8мл, т.е. 10000МЕ в 5мл, значит в 1 мл 10000:5=2000МЕ. Чтобы получить 500МЕ, следует каждый мл развести в 4 раза (2000:500=4), т.е. 1мл сыворотки + 3мл физ.раствора. ІІІ этап микробиологической диагностики дифтерии Просматривают рост выделенной культуры на скошенном сывороточном агаре – возбудитель дифтерии дает на скошенном сывороточном агаре рост в виде шагреневой кожи (т.к. колонии не сливаются). Учитывают результаты пробы на токсигенность и цистиназу. Учет результатов пробы на токсигенность: испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четкие и сливаются с линиями преципитации заведомо токсигенного штамма, т.е. они образую сплошную волнистую линию («взялись за ручки»). Если линии преципитации у испытуемых бляжек перекрещиваются с таковыми у контрольных бляжек, или нечеткие, или совсем отсутствуют, значит испытуемая культура не токсигенна. Учет результатов пробы на цистиназу: при положительном результате через 18-24 часа на среде Пизу по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется черное облачко (фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся при этом сера вступает в реакцию с ацетатом свинца и образуется сернистый свинец черного цвета). Возбудитель дифтерии дает положительный результат пробы на цистиназу, дифтероиды и палочка Гофмана не выделяют фермент цистиназу. При положительной пробе на токсигенность и положительной пробе на цистиназу выделенную культуру идентифицируют. Для чего проверяют чистоту культуры путем приготовления мазка и окраски его по Леффлеру (возбудитель дифтерии имеет зерна волютина на концах – они окрашиваются более интенсивно и располагают в мазке в виде римской пятерки, десятки или растопыренных пальцев). Ложнодифтерийная палочка и дифтероиды имеют зерна волютина на одном конце либо они вовсе отсутствуют и располагаются в мазках в виде частокола или бесформенными нагромождениями. Для изучения сахаролитической активности производят посев на глюкозу (для возбудителя дифтерии + с образованием К), сахарозу (для возбудителя дифтерии -), крахмал (+ только гравис), для изучения уреазной активности производят посев на среду с мочевиной (-). Дата добавления: 2016-03-26 | Просмотры: 1494 | Нарушение авторских прав |