АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Прижизненная (витальная) окраска тканей

Описанные в предыдущих разделах методы обработки материала для микроскопического изучения органов и тканей имеют существенный недостаток: перед исследователем всегда статическое состояние объекта, зафиксированное в момент или после прекращения процессов жизнедеятельности. Естественно стремление биологов иметь на вооружении методы, позволяющие вести наблюдения за живыми органами и тканями. Такая возможность открылась с введением в практику методов прижизненной окраски исследуемого объекта.
Основные требования к прижизненным красителям: минимальная токсичность и избирательное окрашивание отдельных структурных элементов клеток и тканей.
Зная особенности распределения в тканях тех или иных красителей при нормальном функционировании организма, можно определить различные отклонения, наступающие при
тех или иных патологических состояниях. Значительную помощь оказывают витальные красители в эмбриологических исследованиях при изучении развития, так как можно успешно вести наблюдения за перемещением окрашенных клеток. Сказанное в полной мере относится и к изучению тканевых культур (выращивание кусочков органов и тканей на специальных питательных средах).
Как и обычные гистологические красители, все красители для прижизненной окраски разделяют на основные, кислотные и нейтральные.
Основные красители воспринимаются почти всеми клетками, но особенно хорошо клетками и структурами, богатыми липоидами. Именно последнее свойство обеспечивает хорошее прижизненное окрашивание основными красителями нервной ткани.
Кислотные красители окрашивают лишь некоторые виды клеток и в первую очередь клетки ретикулоэндотелиальной системы, обладающие высокой фагоцитарной активностью. Эти клетки играют важную роль в защитной реакции организма. Их способность накапливать прижизненно частицы кислотных красителей позволяет широко применять витальное окрашивание для изучения их функционального состояния. К таким красителям относятся трипановый синий, тушь, литиевый кармин.
Существуют различные способы применения витальных красителей. Крупным лабораторным животным красящие растворы вводят путем внутривенных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций, причем скорость окраски зависит от способа введения (наибольшая — при внутривенном, наименьшая — при подкожном). Лягушкам краситель вводят в спинной лимфатический мешок или брюшную вену. Окраску мелких водных животных производят подкрашиванием воды в аквариуме.
Применяют также метод введения красителя через рот, подмешивая его в пищу.
Обычно красители растворяют в дистиллированной воде или изотоническом растворе хлорида натрия. Однако самым идеальным растворителем является сыворотка крови соответствующего животного, обеспечивающая лучшее всасывание красителя. Для получения такого раствора в стерильных условиях приготавливают 1% сывороточный раствор соответствующего красителя, центрифугируют его (3000—3500 об/мин) и отсасывают надосадочную фракцию пипеткой.
Освоение техники витального окрашивания наиболее удобно в процессе окраски соединительной ткани белых крыс (или мышей) трипановым синим.
Приготовление раствора. Растворяют 1 г трипановой сини в 100 мл изотонического раствора хлорида натрия (или дистиллированной воды). Годность раствора при хранении в прохладном месте 3—4 нед. Перед употреблением раствор красителя фильтруют, стерилизуют (кипячением в течение 10—15 мин) и дают остыть до 25—35°С. Одновременно стерилизуют двухграммовый шприц и иглы.
Подкожная инъекция. Помощник захватывает корнцангом кожу подопытной крысы на затылке, а второй рукой берет животное за кончик хвоста и растягивает на столе спинкой кверху. Экспериментатор, набрав в шприц раствор красителя (из расчета 0,5 мл на 20 г массы тела), свободной рукой оттягивает кожу на спине (или на боковой поверхности тела животного) и, воткнув под кожу иглу, вводит краситель.
Введение внутрибрюшинно. Помощник берет крысу так же, как в предыдущем эксперименте, но вытягивает ее вертикально вниз головой. При таком положении тела происходит перемещение органов брюшной полости к диафрагме, что позволяет легко проникнуть в брюшную полость без повреждения внутренностей. Иглу вводят в левую нижнюю половину стенки живота под острым углом (сверху вниз). Способ более быстрый и простой, чем привязывание за лапки в положении на спине. Концентрация и количество красителя те же, что и при подкожном введении.
Внутривенное введение. Можно производить в хвостовую или яремную вены, предварительно привязав крысу в специальном станке брюшком кверху. Количество красителя вдвое меньше, чем при двух предыдущих способах, концентрация та же. При удачной однократной внутривенной инъекции хорошее окрашивание наступает уже через 24 ч, при внутри брюшинной — через 48 ч. Подкожное введение обычно повторяют несколько раз через 3—4 дня. Наступление общего окрашивания легко определить по посинению слизистых оболочек и радужки глаз. Общее посинение кожных покровов наступает несколько позднее.
Животное забивают одним из принятых способов (декапитация, эфир или хлороформ), производят вскрытие и берут подлежащие исследованию органы и ткани.
Фиксация. Фиксация отложившегося в тканях трипанового синего лучше всего наступает при применении сложных фиксаторов — Буэна (с. 165), Штива и др. Однако, если таковые отсутствуют, можно применять и формалин. При этом следует иметь в виду, что нежные гранулы обесцвечиваются, а краситель диффундирует в другие структуры. Пробные препараты можно приготовить из срезов, полученных на замораживающем микротоме. Обычно же материал заливают в парафин, приготавливают срезы толщиной 5—7 мкм и подкрашивают: при применении трипанового синего (или туши) — кармином или нейтральным красным, при применении литиевого кармина — метиленовым синим и др. Затем обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.

жағдайында табиғи (өмірлік) бояу маталар

зерттеуші өмір процестерді тоқтату немесе осы күннен кейін уақытта жазылған, әрқашан объектінің статикалық мемлекеттік болып табылады: негізгі кемшілігі бар қайта өңдеу материал алдыңғы бөлімдер әдістері ағзалар мен тіндердің микроскопиялық зерттеудің сипатталған. Әрине, тірі дене мүшелері мен тканьдерінің бақылау үшін мүмкіндік береді әдістерін қаруланған болуы ниет биологтар. Мұндай мүмкіндігі объектінің өмірлік бояу әдістерін практикаға енгізу ашылды.

intravital бояулар қойылатын негізгі талаптар: аз уыттылығы және жасушалар мен ұлпалардың жекелеген құрылымдық элементтерінің селективті бояу.

ағзаның қалыпты жұмыс істеуі белгілі бір бояғыштар матаға бөлу сипаттамаларын біле тұра, сіз түрлі ауытқу жүреді анықтауға болады

сол немесе өзге патологиялық жағдайлар. сәтті боялған жасушаның қозғалысы мониторингін жүргізу мүмкін, өйткені айтарлықтай көмек, embryological зерттеулер өмірлік бояғыштар, даму зерттеу арқылы қамтамасыз етіледі. Жоғарыда толығымен (ағзалар мен тіндерді арнайы қоректік БАҚ дана өсіп) тіндік мәдениетін зерттеу қолданылады.

дәстүрлі гистологиялық бояғыштар сияқты, барлық өмірлік бояу үшін бояғыштар, негізгі қышқыл және бейтарап болып екіге бөлінеді.

Негізгі бояғыштар барлық дерлік жасушаларының қабылданады, бірақ липидтерге бай, әсіресе, жақсы жасушалар мен құрылымдар болып табылады. Бұл мүліктің соңғы жүйке тінінің Vivo бояу жақсы базалық бояғыштар қамтамасыз етеді.

Қышқыл бояғыштар жоғары Фагоцитоздық белсенділігі бар, жасушалар мен ретикулоэндотелиальной жүйесін бірінші ұяшыққа тек жекелеген түрлерін бояу. Бұл клеткалар қорғаныс жауап маңызды рөл атқарады. Vivo қышқылы бояғыштар бөлшектердің жинау үшін, олардың қабілеті олардың функционалдық мемлекеттің зерттеу үшін өмірлік бояу кең пайдалануға мүмкіндік береді. Мұндай бояғыштар trypan көк, сия, литий кармин қамтиды.

өмірлік бояғыштар пайдаланып әр түрлі әдістері бар. шешімдерді бояғыш Жабу зертханалық жануарлар көктамырішілік, внутрибрюшинной немесе тері инъекция басқарылады, бояу жылдамдығы (ең - ең төменгі, көктамыр ішіне қарай - тері астына) әкімшілігінің әдісіне байланысты. Frog бояғыш жұлын лимфа МАК немесе іш енгізу Венаға. Шағын су жануарларын түсті аквариум су сәні шығарады.

оның азық-түлік араластыру, аузына арқылы бояу енгізу әдісі ретінде жағыңыз.

Әдетте бояғыштар тазартылған сумен немесе изотоникалық натрий хлоридінің ерітіндісін ерітілген жатыр. Алайда, ең тамаша еріткіш тиісті жануардың қан сарысуы бояғыштар жақсы сіңуін қамтамасыз етеді. мұндай шешім тиісті бояғыш Іркіттің стерильді шарттары 1% ерітінді астында дайындалған алу үшін, ол (/ мин 3,000-3,500 REV) центрифугировали және супернатант тамшуырлар арқылы аспирация отыр.

өмірлік бояу техникасын меңгеру ақ егеуқұйрықтарды (немесе тышқандар) дәнекер тінінде кескіндеме процесінде trypan көк ең ыңғайлы болып табылады.

Ерітінді дайындау. 100 мл trypan көк 1 г натрий изотоникалық ерітінді (немесе тазартылған су) хлориді ерітіңіз. 3-4 апта салқын жерде сақталады шешу фитнес. Қолданар алдында, бояғыш ерітіндісі сүзілген және зарарсыздандырылған (10-15 мин қайнаған арқылы) және 25-35 ° С дейін суытып, Бір мезгілде зарарсыздандырылған шприц пен инені dvuhgrammovy.

Внутримышечного. Ассистент артқы жағындағы қысқыштар эксперименттік егеуқұйрық теріні түсіреді және басқа да сақтық көшірмесін қолмен үстелге құйрығы мен созылып ұшы үшін жануар алады. шприц бояғыш ерітіндісін (20 г дене салмағына шаққанда 0,5 мл ставкасы) тегін қолмен теру экспериментатор теріге тянет бұрын (немесе жануарлар денесінің бүйір бетінде) және теріде иненің етене жабысып, бояғыш кіреді.

Кіріспе внутрибрюшинно. Rat көмекшісі алдыңғы эксперимент бірдей қабылдайды, бірақ ол басына төмен тігінен кеңейтеді. Бұл жағдайда, диафрагма Құрсақ қуысы қозғалыстағы дененің оңай ішкі залал келтірмей құрсақ қуысына еніп қабылдау, бар. Ине сүйір бұрыш (төмен) кезінде құрсақ қабырғасының төменгі сол жартысында енгізіледі. лежачем Аяққа арналған буа қарағанда процесі тез және оңай. бояғыштар концентрациясы және мөлшері бірдей және қашан тері басқарылады.

Көктамыр ішіне енгізу. Сіз арнайы машина іш дейін егеуқұйрығы буа кейін, құйрығы немесе яремной Вена жасауға болады. бояғыштар сомасы концентрациясы бірдей, алдыңғы екі әдістерін жартысынан кем болып табылады. жақсы кескіндеме табысты бір күретамырға салатын перитонеальдық ішінде, ал 24 сағат ішінде жеткізіледі болса -. 48 сағат теріасты препараттан әдетте 3-4 күндері бірнеше рет қайталанады. оңай көк шырышты және көз ирис арқылы анықталған шабуыл жалпы бояу. Барлығы көк тері кейінірек келеді.

Мал қабылданған әдістерін (Обезглавливание, эфир немесе хлороформ) бірін құрбандыққа шалынған және тексеруден органдар мен тіндерді болуға өнімдерін ашылуы қабылданады.

Commit.. Trypan көк үздік кешенді құлыптар қолдану жүреді матаға сақтауға бекіту - олар жоқ болса, Buena (. 165), Shtiva т.б. Алайда, формалин қолданылуы мүмкін. Ол жұмсақ түйіршіктер түсі оңып екенін есте ұстау қажет және бояғыш басқа да құрылыстарды диффундирует. Сынақ дайындық мұздату микротоме алынған секциялар дайындалған болуы мүмкін. Әдетте материалдық парафин құйылады, 5-7 мм бөлімдер дайындалды және боялған қалыңдығын:. trypan көк (немесе тушасы) пайдаланған кезде болды - кармин қызыл немесе бейтарап, литий кармин пайдаланған кезде - метилен көк, т.б. Содан кейін, құрғаған, және жану бальзам енгізілген.

В тех случаях, когда необходимо изучить микроскопическую структуру объекта, имеющего пленчатое строение (серозные и мозговые оболочки, соединительнотканные мембраны и т. д.), приготавливают целостные (тотальные) препараты. Для этого иссекают подлежащий исследованию участок пленки и во избежание образования складок перед фиксацией накалывают в расправленном состоянии на восковую (или пробковую) подушку (см. с. 153).
По окончании фиксации материал обрабатывают обычным способом: отмывают фиксатор, окрашивают, обезвоживают, просветляют и заключают в соответствующие среды.

Дата добавления: 2016-06-06 | Просмотры: 852 | Нарушение авторских прав