АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Шаг 2: 24-36 ч до начала работы

1. Растворите лиофилизованный штамм бактерий

Используя стерильную пипетку, добавьте 250 мкл среды LB во флакончик с лиофилизованным штаммом E. coli HB101. Закройте флакон и дайте суспензии клеток постоять 5 минут при комнатной температуре. Хорошо встряхните флакон, чтобы перемешать содержимое и поставьте в темостат на 37ºС на 8-24 ч. Если термостата нет, налейте в большую емкость воды, нагретой до 37ºС, поместите туда флакон с бактериями и оставьте на ночь- на сутки. Ресуспендированные клетки хранятся в холодильнике не больше трех дней. (лучше использовать их в течение 24 часов).

1. Рассейте бактерии штрихом по «стартовым» чашкам

Каждой паре учеников, работающих за одним рабочим столом, понадобится своя собственная «стартовая» чашка, с которой они будут брать колонии для трансформации. Чашки LB должны быть засеяны штрихом, для получения одиночных колоний (см. ниже) и поставлены в термостат на 37ºС за 24-36 ч до начала работы (если вы собираетесь растить клетки при комнатной температуре, вам понадобится больше времени).

Используя полученную на предыдущем шаге бактериальную суспензию, засейте 8 чашек LB штрихом (по одной чашке на каждое рабочее место). Цель рассевания штрихом – развести бактериальную суспензию до отдельных клеток, которые дадут отдельные колонии на чашке. В благоприятных условиях, 1 клетка превратится в миллионы генетически идентичных клеток всего за 24 часа. Бактериальная колония диаметром 1 мм содержит миллионы клеток.

1. Опустите стерильную петлю в бактериальную колонию, пробирку с суспензией бактерий или другой ваш образец. Держите петлю прямо, без наклона. Выньте петлю и мягко проведите ей несколько раз по агару в углу чашки, как показано на рисунке. Первый штрих разбавляет клетки. Проведите несколько штрихов в той же части чашки. Старайтесь не повредить поверхность агара.

1. Для следующих штрихов надо использовать как можно большую поверхность чашки. Поверните чашку под углом 45° (чтобы вам было удобнее делать штрихи) и делайте второй широкий штрих. Не опускайте петлю в исходный материал! Один или два раза зацепите первый штрих и разотрите его как показано на рисунке.

С каждым следующим штрихом вероятность появления отдельных колоний увеличивается, так как клетки становятся все более и более разбавленными. Помните, что отдельная колония происходит из одной клетки и все клетки в составе колонии генетически идентичны.

1. Поверните чашку еще на 45° и сделайте третий штрих
2. Поверните чашку еще раз и сделайте последний штрих. Не зацепите первый!
3. Переверните чашку и поставьте ее в термостат на 37°С на ночь или оставьте на 2-3 дня.на столе при комнатной температуре. Используйте их для трансформации не позже чем через 36 часов, после того как клетки вырастут, в противном случае трансформация может не получиться (для успешной трансформации, клетки должны находиться в состоянии активного роста). НЕ ПОМЕЩАЙТЕ ЧАШКИ В ХОЛОДИЛЬНИК
4. E. coli образует желтовато-белые колонии круглой формы с гладкими краями. Не используйте заросшие другими бактериями или грибами чашки.

1. Приготовьте плазмиду pGLO

Возьмите чистую стерильную пипетку и перенесите 250 мкл трансформационного раствора во флакон с сухой плазмидой. ДНК очень мало, поэтому вам может показаться, что во флаконе ничего нет. Переверните несколько раз флакон, чтобы хорошо перемешать содержимое и убедиться, что ДНК растворилась и не прилипла к крышке. Храните растворенную ДНК в холодильнике..(раствор для трансформации используется здесь только потому, что это стерильный раствор, имеющийся в составе набора. Вместо него можно использовать стерильную воду, если она есть в наличии).

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 429 | Нарушение авторских прав