АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами.

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 4). Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий (амплификации) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.

ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов: 1)фермент ДНК-полимераза; 2)пара олигонуклеотидных праймеров; 3)набор нуклеотидов; 4)копируемая ДНК; 5)ионы Mg +2, необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.

Для амплификации (т.е. синтеза ДНК-матрицы) отбирают наиболее консервативную часть, уникальный ген. Для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера (короткие, длиной 20-30 оснований одноцепочечные фрагменты ДНК), комплементарные 3 ¢ -концам ДНК искомого гена. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками (отжиг). Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3' -концам праймеров, формируется специфический фрагмент (ампликон). После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза. Рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10 8 ампликонов. Реакцию проводят в специальных приборах - амплификаторах. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом гель-электрофореза и визуализацию в УФ свете после окрашивания этидием бромида. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю можно провести ДНК-гибридизацию.

Параграфы на тему „Генетика микроорганизмов“:

— Конъюгация микроорганизмов

В 1946 г. Дж. Ледерберг и Э. Татум описали феномен конъюгации — передачи генетического материала из клетки в клетку при непосредственном контакте бактерий. Исследования проводились на штамме Е. coli К12. Перенос генетического материала происходил толь1 ко в одном направлении; одна клетка являлась донором, другая — реципиентом.

— Трансформация микроорганизмов

Трансформация (от transformatio — преобразование) изменение свойств бактериальной клетки в результаате процесса переноса информации, при котором фрагмент ДНК клеткидонора проникает в родственную бактерию.

— Рекомбинация у бактерий

У бактерий, так же как при изучении генетики высших организмов, принято выделять понятия: генотип, фенотип, модификаци

— Трансдукция микроорганизмов

Осуществление переноса генетического материала от клетки донора к бактерииреципиенту с помощью фага получило название трансдукции. Траисдуцирующий фаг переносит фрагмент ДНК из предыдущего хозяина и вводит эту ДНК таким же образом, как и свою собственную молекулу ДНК, в чувствительную к нему бактериальную клетку.

— Плазмиды микроорганизмов

Кроме хромосомы, у некоторых бактерий обнаруживаются дополнительные внехромосомные генетические детерминанты, получившие название плазмид. К настоящему времени обнаружено большое разнообразие плазмид, среди которых наиболее изученными являются половой фактор (F), фактор множественной лекарственной устойчивости (R), факторы бактериоциногений (Col), плазмиды, контролирующие у Е. coli синтез энтеротоксина (Ent), обеспечивающие продукцию гемолизина (Н1у), детерминирующие синтез поверхностных антигенов (К88, К99) и др.

— Что такое генетика. ДНК.

Генетика — наука о наследственности и изменчивости. Наследственность характеризует сохранение постоянства свойств вида в поколении, т. е. воспроизведение себе подобных. Изменчивость — различия в свойствах между особями одного вида.

— Мутация

Под мутацией (от mutatio — изменение) подразумеваются стабильные наследуемые изменения в генотипе, проявляющиеся фенотинически в виде измененного признака. Основу мутации составляют качественные или количественные изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, которые могут возникать при жизнедеятельности бактерий под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических мутагенов.

Дата добавления: 2015-05-19 | Просмотры: 1363 | Нарушение авторских прав