АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Частная вирусология

Эта реакция была предложена К.Мюллисом в 1983 г, получившим за свое открытие Нобелевскую премию (1993).Это открытие стало настоящим прорывом в молекулярной биологии и медицине. Следует отметить, что способ получения и свойства главного компонента реакции - фермента термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерии Thermus aquaticus был опубликован А. Калединым с соавторами в 1980 г.

Полимеразная цепная реакция, также как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарное™ цепей ДНК. Новым важным принципом реакции является использование термо стабильной ДНК-пол им еразы, при участии которой происходит амплификация - умножение определяемых генов (вирусных, бактериальных) или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительной количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Именно на амплификации генов или их фрагментов основана "сверхчувствительность" этой реакции.

В реакции участвуют следующие ингредиенты: - определяемая ДНК вирусов или других инфекционных агентов в испытуемом биологическим материале, который предварительно концентрируется;

- праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) - короткие
цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью
комплементарной 3' концам каждой да двух цепей определяемой
ДНК. Праймеры получают из генов различных вирусов и бактерий,
их нуклеотидную последовательность определяют методом
секвенирования;

- свободные нуклеотиды (дезоксирибонукяеозидтрифосфаты
4-х типов с различными азотистыми основаниями) - необходимый
материал для осуществления амплификации;

-фермент термостабильная ДНК - полимераза -производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Кроме термостабильной ДНК полимеразы выделяемой из Thermus aquaticus, этот фермент получают генно-инженерным методом.

Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3' концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат "затравками" для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цеди свободные нуклеотиды.

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается (из одной матрицы ДНК образуется две копии), то есть происходит амплификация ДНК, Обычно проводят 25 - 40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов, бактерий и др, (по формуле: 2^П, где п равно количеству циклов),

Полимеразную цепную реакцию проводят в 0,5 - 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амллификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации - денатурации ДНК, отжига и достройки - необходима инкубация образцов при различном температурном режиме (см. схему ПЦР, стр. 74).

1) Денатурация разъединение определяемой

двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90°- 95° С в течение 0,5 - 1,0 мин.

2) Отжиг восстановление двухцепочечной структуры
определяемой ДНК в области присоединения комплементарного
праймера - проводится при температуре 40-60 С 0,5 мин.

3) Удлинение (элонгация) - достройка каждой цепи
определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состояния с
помощью термостабилыюй ДНК - полимеразы - проводится при
температуре 70°- 75° С в течение 2-5 мип.

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакрил амид ном геле, авторадиографией (при участии в реакции свободных нуклеотидов, меченных изотопами) или другими методами. ПЦР высокоспецифичная реакция: если исследуемый образец не был комплементарен враймерам, то результат реакции отрицателен.

С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК- вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскрштгазу).

Таким образом, ПЦР является высокочувствительным и специфичным молекулярно-генетическим методом исследования, позволяющем выявлять присутствие различных вирусов и многих других патогенных агентов. Метод особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекпии. ПЦР применяют также при диагностике холеры (обнаруживают ген, детерминирующий синтез энтеротоксина у холерного вибриона), бруцеллеза, легионеллеза, микобактериозов и других инфекций.

В последние годы ПЦР приобретает вес большее значение, как ценный экспресс-метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Частная вирусология

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 765 | Нарушение авторских прав