АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Перспективы получения и использования нуклеозидов

Фармацевтическая промышленность Республики Беларусь сильно зависит от закупок субстанций за рубежом. Из местных источников сырья для получения лекарственных средств используется только сырье растительного и животного происхождения, а также целевые метаболиты, получаемые путем микробного синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и аминокислоты).

Важным сырьем для производства ряда лекарственных препаратов является РНК, полученная из дрожжевой массы. РНК − исходный материал для выделения индивидуальных рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, цитидина, уридина), которые в свою очередь являются исходным сырьем для синтеза более чем 20 ценных лекарственных препаратов, а также пищевых добавок. В первую очередь, это препараты сердечно-сосудистого действия – АТФ, фосфаден (АМФ), рибоксин, уридин.

Аденозин является исходным материалом для получения противовирусных препаратов (аденинарабинозид – против вируса герпеса), препаратов с антигипертензивной активностью (производные аденозин-5-карбоновой кислоты), противовоспалительных и обезболивающих препаратов.

На основе цитидина получают цитозинарабинозид и циклоцитидин (для лечения лейкозов), 5-фторциклоцитидин (противоопухолевое средство), циклоцитидинмонофосфат (противовирусный препарат).

Производные гуанозина применяются в качестве иммуностимуляторов. На основе гуанозина производятся тиогуанин (противолейкозный препарат), ацикловир (противовирусный).

Уридин используется как безвредный стимулятор физических сил организма при напряженной работе, после длительной болезни, для лечения депрессивных состояний, сосудистых заболеваний мозга. Производные 5-фторуридина являются противоопухолевыми средствами.

Интенсивно ведутся научные исследования по созданию новых лекарственных форм на основе нуклеозидов (в том числе для борьбы с вирусным заболеванием СПИД).

Известны следующие основные способы получения нуклеозидов:

1) экстракция нуклеиновых компонентов из мышц млекопитающих и птиц;

2) химический синтез;

3) микробиологический синтез;

4) гидролиз нуклеиновых кислот.

Экстракционный метод требует большого количества ценных пищевых продуктов: из 1 кг мышц минтая получают всего 25 мг АТФ, 40 мг АДФ и 35 мг АМФ.

Химический синтез сложен, но некоторые синтетические нуклеозиды коммерчески доступны. Например, химическим аминированием инозина (рибоксина) получают аденозин. Разработан метод ферментативного синтеза нуклеозидов с помощью фермента нуклеозидфосфорилаза, образующего N-гликозидную связь между азотистым основанием и пентозным остатком.

Перспективен микробиологический способ синтеза нуклеозидов. Например, Bacillus subtilis синтезирует 12–13 г/л инозина (рибоксина); получен мутантный штамм Bacillus subtilis 556, образующий до 55 г/л инозина. Бактерии Bacillus pumilus способны накапливать в среде 29,6 г/л инозина и (или) 4,2 г/л гуанозина. В Японии получен мутантный штамм Bacillus subtilis, накапливающий 10,4 г/л цитидина в культуральной жидкости.

Самым технологичным и доступным методом промышленного получения всех четырех нуклеозидов риборяда является гидролиз РНК.

Технические препараты РНК производят из дрожжевой массы. Основная задача при этом – достичь высокого выхода РНК (85–90% от РНК, содержащейся в клетках дрожжей) при высоком содержании основного вещества в техническом препарате (не менее 75%).

Существуют различные методы выделения РНК из дрожжевой массы, но наиболее экономичным считают процесс экстракции РНК 10–12%-ным раствором NaCl в щелочной среде при температуре 85–90°С.

Процессуальная схема получения технической РНК представлена на рис. 15.1.

Гидролиз РНК осуществляют различными методами:

– ферментативный гидролиз с использованием иммобилизованных нуклеаз или интактного мицелия штамма Spicaria violacea;

– кислотный гидролиз;

– щелочной гидролиз.

Из ферментативных методов наиболее отработано применение мицелия гриба Spicaria violacea. Полнота гидролиза РНК в этом методе достигает 80%. Однако получение мицелия Spicaria violacea направленным культивированием гриба с содержанием требуемого набора РНК-гидролизующих ферментов в достаточном количестве является дорогостоящим и труднорегулируемым процессом. Ферментный состав мицелия сильно зависит даже от незначительных изменений условий культивирования.

Рис.15.1. Схема получения технической РНК из дрожжевой массы

Кислотный гидролиз РНК в мягких условиях (рН 4) приводит к получению сложной смеси из-за сопутствующего разрыва гликозидной связи в пуриновых нуклеотидах. Гидролиз формиатом аммония осуществляют в жестких условиях (230°С). В щелочной среде образуется смесь нуклеотидов, нуклеозидов и олигонуклеотидов.

В качестве гидролизующих агентов целесообразно использовать соединения, образующие с ионами РО₄^3- нерастворимый осадок. Этим требованиям отвечают соединения кальция и магния. Разработан процесс гидролиза РНК в присутствии гидроксида свинца (НПО «Биолар», Латвия), но практическое применение метода ограничено серьезными недостатками процесса: экологическими проблемами с отходами, содержащими свинец, и присутствием в препаратах остатков соединений свинца.

Наиболее приемлема разработанная в Республике Беларусь технология гидролиза РНК оксидом кальция. Процесс гидролиза РНК оксидом кальция осуществляют при температуре 130–135°С, давлении 0,2–0,3 МПа в течение 3 ч. В этих условиях РНК гидролизуется на 80–90%. При гидролизе образуется фосфат кальция, который выпадает в осадок и легко отделяется фильтрованием.

Из числа нуклеозидов гидролизата наименее растворим в воде гуанозин. Он выпадает в осадок даже из теплых окрашенных гидролизатов без дополнительной обработки. При охлаждении гидролизата гуанозин кристаллизуется. Содержание основного вещества в кристаллах 80–85%. Для получения продукта высокой чистоты технический гуанозин подвергают перекристаллизации с очисткой активированным углем. Обработку углем осуществляют при температуре 80–90°С. После отделения угля раствор охлаждают до комнатной температуры и кристаллизуют в течение 48 ч. Кристаллы отделяют фильтрованием через капроновую ткань промывают дистиллированной водой и этанолом и сушат при 40–50°С (рис. 15.2).

Гидролизат после выделения гуанозина концентрируют упариванием при 70°С под разрежением и разделяют нуклеозиды ионообменной хроматографией на сильноосновном анионите АВ-17-2М в ОН^–-форме. Для элюирования нуклеозидов используют дистиллированную воду, растворы слабых кислот. Цитидин выделяют, используя в качестве элюента дистиллированную воду. Цитидиновую фракцию упаривают под разрежением (70°С), очищают активированным углем (50% угля от массы цитидина) при температуре 95–100°С. После отделения угля раствор упаривают (70°С), в концентрат добавляют этанол и кристаллизуют при 4–6°С в течение 48 ч. Кристаллы сушат при 40–50°С.

Рис. 15.2. Процессуальная технологическая схема

получения препаратов индивидуальных рибонуклеозидов

После элюирования цитидина продолжают подачу дистиллированной воды в колонку и собирают аденозинсодержащую фракцию. Аденозин элюируется медленно, и фракция имеет низкую концентрацию аденозина. Чтобы избежать упаривания больших объемов воды, фракцию направляют на колонку с катионитом КУ-2-8 в Н+-форме. Элюируют аденозин с катионита 1 н. раствором NH₄OH. Элюат упаривают (70°С) до концентрации аденозина 60–80 г/дм³ и кристаллизуют при температуре 4–6°С в течение 48 ч. Технический аденозин подвергают перекристаллизации из водного раствора. Раствор охлаждают и кристаллизуют при температуре 4–6°С в течение 48 ч. Кристаллы промывают водой и этанолом и сушат.

При элюировании цитидина и аденозина дистиллированной водой присутствующие в гидролизате окрашенные примесеи и уридин задерживаются анионитом. Элюирование уридина осуществляется ээфективно 0,5 н раствором уксусной кислоты. Однако полученная фракция сильно окрашена. Ее подвергают очистке обработкой активированным углем и дополнительно очищают на анионите АВ-17-2М в CH₃COO^–-форме. С колонки элюируют уридин водой. Раствор упаривают (70°С) до концентрации 300–500 г/дм³, охлаждают, добавляют этанол и кристаллизуют при 4–6°С в течение 48 ч. Кристаллы высушивают при 40–50°С.

Расход технической РНК для получения 1 кг препарата аденозина составляет 8,45 кг; гуанозина – 6,00 кг; цитидина – 11,55 кг; уридина – 9,23 кг.

Полученные препараты нуклеозидов представляют собой растворимые в воде белые порошки.

Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 1124 | Нарушение авторских прав