 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Окраска по методу ГрамаЗанятие № 2 Микроскопический метод исследования, морфология микроорганизмов (продолжение) Морфология, ультраструктура бактерий Сложные методы окраски предполагают использование нескольких красителей и дают возможность дифференцировать одни микробы от других, а также изучать особенности строения микробных клеток. К ним относят окраску по Граму, Цилю- Нильсену, Нейссеру, Романовскому–Гимзе и др. Дифференцирующий метод окраски, предложенный Хансом Христианом Иоахимом Грамом в 1884 г., не утратил практического значения до настоящего времени. Окраска по методу Грама При окраске этим методом все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные, что облегчает проведение дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний и выбор средств антимикробной терапии. Грамположительные бактерии и дрожжи после окрашивания кристаллвиолетом и связывания с йодом не обесцвечиваются в органических растворителях, оставаясь сине-фиолетового цвета; грамотрицательные – обесцвечиваются (возможно, за счет высокого содержания липидов и отсутствия тейхоевых кислот в клеточной стенке), становясь красными после докрашивания сафранином или фуксином. Общепринятый метод. Следует подготовить следующие растворы: 1) спиртовой раствор генцианового или кристаллического фиолетового; 2) йодный раствор Люголя; 3) обесцвечивающий раствор (95%-й этиловый спирт и/или ацетон); 4) фуксин Пфейффера или сафранин. Спиртовой раствор генцианвиолета Генциан фиолетовый....................... 20 г Спирт этиловый (95%-й)................. 200 мл Вода дистиллированная.................. 800 мл Генциан фиолетовый, метиловый фиолетовый и кристаллический фиолетовый принадлежат к красителям трифенилметанового ряда, что позволяет применять их в одинаковой степени для окраски по методу Грама. Краситель растворяют, растирая в ступке с добавлением спирта, затем добавляют воду, настаивают в течение 1 сут при комнатной температуре и фильтруют готовый раствор. Йодный раствор Люголя Иод кристаллический (I2)................ 1 г Калия иодид..................................... 2 –5 г Вода дистиллированная.................. 300 мл Смешать ингредиенты и оставить на сутки для растворения йода (иногда приходится добавлять кристаллы KI). Обесцвечивающий раствор Ацетон............................................. 400 мл Спирт этиловый (95%-й)................ 1200 мл Внимание! Отдельные компоненты и смесь огнеопасны. Возможно использование компонентов по отдельности или в других оотношениях. Обесцвечивание ацетоном происходит более быстро. Раствор сафранина Сафранин (2,5%-й раствор в 95%-м этиловом спирте)...................... 25 мл Вода дистиллированная......................... 75 мл Вначале готовят 2,5%-й спиртовой раствор сафранина, затем смешивают его в указанной пропорции с водой. В нашей стране в качестве второго красителя чаще используют фуксин Пфейффера (см. выше), который лучше прокрашивает, например клетки грам-отрицательных анаэробов. Окраска по Граму состоит из четырех этапов.
Окраска по Граму позволяет дифференцировать возбудителей инфекционных заболеваний. Так, например, известно, что все болезнетворные кокки, кроме гонококка и менингококка, являются грамположительными; вибрионы, трепонемы, кампилобактеры, хеликобактеры и энтеробактерии – грамотрицательными, все патогенные бациллы и клостридии – грамположительными. Существует множество модификаций окраски по Граму (с использованием тартразина и светлого зеленого, основного фуксина и др.). Чаще всего усовершенствования направлены на улучшение окраски грамотрицательных микроорганизмов и тех, которые плохо окрашиваются общепринятым методом.
Обнаружение кислотоустойчивых бактерий требует специальных методов окраски. Кроме Гр+ и Гр- бактерий в отдельную группу выделены кислотоустойчивые бактерии. В эту маленькую группу входят некоторые актиномицеты, микобактерии, отдельные родственные им бактерии и покаящиеся эндоспоры. Окраска по Цилю-Нильсену. Метод используется для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулеза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и некоторых других микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесенный на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта. Окраска микроорганизмов по методу Циля-Нильсена включает следующие этапы.
При окраске по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.
Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы к обесцвечиванию. Окраска спор по Ожешке. Густой мазок высушивают на воздухе, протравливают 0,5%-м раствором соляной кислоты и подогревают до появления паров. Затем препарат промывают водой, высушивают, фиксируют над пламенем и окрашивают по способу Циля – Нильсена. Споры приобретают розово-красный, а клетка – голубой цвет.
Теория Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1211 | Нарушение авторских прав |
На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, на которую наливают раствор генцианвиолета на 30 – 60 с (при окраске по методу Синева мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, заранее пропитанной раствором генцианового фиолетового и высушенной, на бумагу наносят 2 – 3 капли воды и выдерживают 1 – 2 мин), затем раствор сливают.
Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги и наливают на нее феноловый фуксин Циля (можно пользоваться фильтровальной бумагой, предварительно пропитанной красителем и высушенной). Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят в сторону для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2 – 3 раза (~5 мин). После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водопроводной водой.