АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Подготовка образцов для спектрального рентгеновского микроанализа

Все биологические образцы содержат большое количество внутриклеточной и интерстициальной жидкости, в которой растворены различные органические и неорганические вещества. Чтобы клетки были стабильны под электронным лучом в вакууме, необходимо удалить или заморозить всю жидкость. Наблюдения замороженных образцов и исследования клеток с помощью рентгеновского микроанализа можно проводить при помощи специальной охлаждающей камеры, способной поддерживать определенную отрицательную температуру (температуру жидкого азота) для предотвращения сублимации льда из образца под высоким вакуумом. В отсутствии такой камеры производят удаление жидкости из образца следующими методами: высушивание на воздухе, высушивание переходом критической точки, замораживание-высушивание. Однако, в зависимости от типа биологического образца необходимо правильно подобрать методику подготовки его для исследования. Различные типы образцов имеют разное пространственное разрешение в рентгеновском микроанализе, зависящее от объема области генерации излучения в образце. Этот объем является как функцией диаметра пучка и глубины проникновения электронов, так и рассеяния электронов и рентгеновского излучения внутри образца. Наример, твердые ткани – кости, раковины, древесина и др., имея сильно неоднородную поверхность, с многочисленными разломами требуют предварительной полировки поверхности особо чистыми абразивами до начала применения различных фиксаторов. Прежде чем начинать работу по препарированию образца, необходимо определить стратегию исследования:

1) необходимо сохранять адекватными нормальные структурные взаимосвязи объекта. Трудно установить пределы сохранения морфологии, но хорошим требованием было бы достижение морфологического пространственного разрешения по величине на порядок лучше, чем ожидаемое пространственное разрешение в режиме рентгеновского микроанализа;

2) необходимо знать количество утраченного или приобретенного образцом материала. Это может быть достигнуто при выполнении объемного химического анализа на одной половине идентичного объекта до препарирования. Хотя такой способ дает лишь общую элементную концентрацию образца, он реально показывает, были ли основные изменения результатом данной процедуры препарирования.

3) необходимо знать химический состав утраченного или приобретенного образцом материала. Важно знать не только, произошли ли изменения концентрации элементов в образце, но и являются ли эти изменения селективными. Элементы в биологических образцах обычно размещаются в различных фрагментах, каждый из которых имеет различный состав. Внутри любой перегородки одного фрагмента элементы могут быть слабо или сильно связаны, и процедура препарирования может селективно воздействовать на концентрацию определенного элемента.

4) необходимо знать количество перераспределенных и перемещенных внутри образца элементов. Несмотря на то что данная методика препарирования может не изменять общую концентрацию элементов в системе, она может вызвать сильное перераспределение элементов внутри ткани. Искусственное движение материала в образце является самым сложным явлением, которым надо управлять. Наблюдение необычайно высоких концентраций элементов как в кристаллах, так и в осадках под­тверждает наличие перераспределения.

5) элементы, используемые для препарирования образцов, не должны маскировать элементы, подлежащие анализу. Если исследуются спектры характеристического рентгеновского излучения элементов, то возможно увидеть перекрывание линий их К-, L- и М-излучения, в особенности в спектрах, полученных с помощью рентгеновского спектрометра с дисперсией по энергии с его плохим разрешением по энергии. Пока не приняты соответствующие меры, L- или М-излучение одного элемента может перекрываться и маскировать излучение анализируемого элемента.

Необходимо четко понимать, что не существует другой надежной аналитической процедуры для подтверждения точности микроанализа на этом уровне, независимую оценку точности анализа получить сложно.

Методы препарирования образцов. Принципы методов препарирования образцов для исследования с помощью рентгеновского микроанализа не отличаются от приемов подготовки образцов в РЭМ и ТЭМ, но имеют свои специфические особенности, о которых будет идти речь.

Фиксация. Самым важным моментом является правильный выбор фиксатора, который не вызывает потерь, перераспределения или маскирования анализируемых элементов. Проведено большое число работ по вопросу фиксации образцов, но результаты не однозначны, авторы склоняются к тому, что все методы фиксации оказывают некоторое воздействие на исходные распределения элементов в тканях. В связи с опасностью экстракции содержащихся растворимых веществ и вероятности внесения тяжелых элементов, рентгеновские пики которых могут маскироваться или налагаться на излучение интересуемых элементов, по-видимому, лучше не проводить окрашивание образцов.

Подложки для образцов. В ходе рентгеновского микроанализа луч пронизывает образец насквозь, в связи с этим подложка для образца должна быть хорошим проводником и сделана из материала, который не давал бы вклада в рентгеновский сигнал, идущий с образца. Для массивных образцов или срезов, изучаемых в режиме вторичных электронов, образцы обычно помещают на хорошо отполированные сверхчистые углеродные, алюминиевые или бериллиевые диски. Материалы, которые нужно исследовать с помощью световой оптики, должны монтироваться на кварцевых или прозрачных пластиковых пленках, которые для создания проводимости должны покрываться тончайшим слоем (~5 - 7 нм) алюминия. Для материалов в виде среза пригоден целый ряд подложек, в основном на основе стандартной сетки (3,08 мм) для просвечивающего электронного микроскопа. Можно применять сетки, изготовленные из меди, титана, никеля, алюминия, бериллия, золота, углерода и нейлона. Массивные образцы должны закрепляться на подложке для образца проводящей пастой высокой чистоты, такой, как коллоидный углерод, и важно проверять, чтобы рентгеновское излучение клеящего вещества не было бы помехой при исследованиях.

В настоящее время существуют два основных направления в препарировании объектов для РМА:

1) клетки осаждают на подложку или выращивают на ней; затем объекты быстро замораживают и высушивают из замороженного состояния или изучают замороженные объекты на охлаждаемом до t = -173°С столике ЭМ;

2) проводят криоультратомию замороженных объектов; последующее исследование криоультратонких срезов в замороженном состоянии.

Все остальные этапы подготовки биологических образцов для исследования для РМА такие как: обезвоживание, высушивание, замораживание, ультрамикротомия, нанесение покрытия на образец рассматривались в гл. Электронная микроскопия.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 756 | Нарушение авторских прав