АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Общие сведения. Тема: Лабораторная диагностика лептоспироза и кампилобактериоза

Лабораторная работа №14

Тема: Лабораторная диагностика лептоспироза и кампилобактериоза

Цель занятия: Изучить морфологию, культурально-биохимические и тинкториальные свойства возбудителей лептоспироза и кампилобактериоза. Ознакомиться с методами микробиологической диагностики патогенных спирилл, биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Готовые фиксированные неокрашенные препараты с лептоспирами и кампилобактериями; лептоспирозные агглютинирующие сыворотки, антигены для диагностики лептоспироза в РМА, таблицы.

Общие сведения

Лептоспиры и кампилобактерии встречаются по всему земному шару. Лептоспиры - гибкие спиралевидные клетки диаметром 0,1 мкм и длиной от 6 до 20-24 мкм. Слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Хорошо заметны в темном поле и при фазово-контрастной микроскопии. Конформация спирали правозакрученная (по часовой стрелке). Аэробы. Для роста нуждаются в присутствии в среде сыворотки или сывороточного альбумина. Патогенные лептоспиры составляют 25 серологических групп, включающих 124 серологических варианта, из них от сельскохозяйственных животных выделено семь — L.icterohaemorragiae, L. pomona, L. tarassowi, L. grippotyphosa, L. hebdomadis, L. canicola, L. cazackstanika.

Кампилобактерии (тонкие, вибриоидные клетки диаметром 0,2-0,5 мкм и длиной 0,5-5,0 мкм.) встречаются в корнях растений, обнаруживаются в репродуктивных органах. Кишечном тракте и ротовой полости человека и животных.

Основные виды кампилобактерии: C.fetus (подвиды С. fetus venerealis и C.fetus sb. fetus), C.jejuni, C.sputorum (подвиды С. sputorum sputorum, C. sputorum bubulus, C. sputorum faecalis) и непатогенный С. Coli. С. fetus sb. Fetus вызывает аборты у овец, крупного рогатого скота. С. fetus venerealis - патогенен для крупного рогатого скота. C.jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных. С. mucozalis патогенен для свиней; выделяют при признаках некротического энтерита и локального илеита.

1.1 ЛЕПТОСПИРОЗ - инфекционная болезнь разных видов животных и человека. Наиболее часто болезнь протекает с кратковременной лихорадкой в острой и подострой форме; гемоглобинурией (особенно у телят), желтушностью слизистых оболочек. У коров и свиноматок возможны аборты. Переболевшие животные длительное время остаются лептоспироносителями.

Возбудитель лептоспироза. Принадлежит к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Leptospira.

Морфология (микроскопия). Лептоспиры представляют собой тонкие

длинные спиралеподобные микроорганизмы длиной 10...15 мкм и шириной 0,1...0,2 мкм, количество спиралей (завитков) 10...12 и более. Споры и капсулы не образуют. На концах лептоспир имеются утолщения. Движение маятникообразное. Подвижность сохраняется не более 2 ч с момента взятия крови или мочи.

Материал для исследования. В лабораторию направляют при жизни животного мочу, кровь в период лихорадки; посмертно — труп или кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод или органы плода. Жидкие субстраты отсасывают в стерильные пробирки. Патологический материал доставляют с нарочным в опечатанном ящике не позднее 6 ч после гибели животного в летнее время и 12 ч зимой. Воду (до 2 л) на наличие лептоспир направляют в лабораторию в бутылях (колбах). Из патологического материала готовят нативные неокрашенные препараты для микроскопирования методом «раздавленной капли» в темном поле зрения. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновые краски. По Граму окрашиваются отрицательно, по методу Романовского-Гимза через 48ч — в розово-фиолетовый цвет, по методу Киктенко — в красно-фиолетовый цвет (на бесцветном фоне).

Метод Киктенко заключается в том, что на нефиксированный препарат наносят специальный раствор (0,2 г танина, 2 мл формалина, 5 мл 4 %-го спиртового раствора йода, 100 мл дистиллированной воды). Выдерживают 1 мин, сливают и наносят другой краситель (1 г генцианвиолета в 100 мл 25%-го этилового спирта) на 50с при подогревании. После этого препарат промывают, высушивают и микроскопируют под иммерсией.

Культивирование. Выделение чистой культуры. Производят посевы патологического материала на полусинтетическую среду ГНКИ, состоящую из овечьего альбумина, воды и компалона (фактора роста), или на среды Любашенко и Терских, в основу которых взят фосфатно-буферный раствор на 5 % кроличьей сыворотки и 1 % пептона, дистиллированная вода; рН среды 7,2...7,4. Лептоспиры — факультативные аэробы. Оптимальная температура роста культивирования 28...30°С. Культивирование составляет 7...20 сут. Среда остается прозрачной, рост культуры определяют микроскопированием препаратов из нее. Если макроскопически виден рост (помутнение среды и осадок) — культура загрязнена.

Патогенность (биопроба). Определяют биопробой: выделенной культурой заражают морских свинок или золотистых хомяков, крольчат 3...5- недельного возраста Культуру или взвесь исследуемого растертого материала инъецируют подкожно или внутрибрюшинно хомякам в дозе до 1 мл, крольчатам - 2...3 мл (по два животных на каждую пробу). Одного убивают через 4...5сут., второго — спустя 14...16сут., вскрывают и проводят бактериологическое исследование.

Лептоспиры продуцируют ферменты (плазмокоагулазу, липазу и лецитиназу) и экзотоксины (гемотоксин, некротоксин), а также эндотоксин. В культуре ткани лептоспиры проявляют цитопатогенное действие.

Серологические методы. Чаще используют для прижизненной диагностики лептоспироза. Кровь от животных допускается исследовать лишь через два месяца после их вакцинации. Самым распространенным методом является реакция микроагглютинации (РМА) со свежей, высушенной на фильтровальной бумаге или консервированной 0,5 %-м раствором фенола сывороткой. Сначала готовят разведения сыворотки — 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 (при необходимости и больше), затем добавляют антиген — живые культуры лептоспир.

Удобно ставить реакцию в следующей модификации: из каждого разведения сыворотки (начиная с большего) по 0,1 мл вносят в 6...13 лунок пластины для серологических реакций или в пробирки Флоринского в зависимости от количества имеющихся в лаборатории антигенов — живых культур диагностических штаммов лептоспир. Каждый антиген — 5...15-суточная культура лептоспир с концентрацией 70... 100 микробных тел в поле зрения микроскопа (предварительная проверка) - вносят по 0,1 мл в четыре лунки (пробирки) с разными разведениями сыворотки по 0,1 мл. Электролитной средой служит 0,85 %-й раствор хлорида натрия. Антигены с сывороткой встряхивают, помещают в термостат на 1 ч при 30 °С. Контроль - культура лептоспир с физиологическим раствором (также по 0,1 мл). Используют иммуноферментный анализ.

Для учета реакции используют микроскопию: из каждой пробирки (или лунки) готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют его в темном поле микроскопа при увеличении 20 х 10. При наличии гомологичных антигену антител в сыворотке происходит агглютинация — образуются агглютинаты склеенных лептоспир в виде паучков или пучков, сохраняющих подвижность на свободных концах. Результат РМА оценивают в крестах: «++++» — агглютинация 100 % лептоспир, «+++» — 75 %, «++» — 50 %, «+» - 25 % лептоспир; «—» — агглютинация отсутствует. В небольших разведениях сыворотки наблюдают набухание и неподвижность, зернистость и лизис лептоспир. Положительная реакция признается с оценкой в четыре и три креста, два креста—результат сомнительный.

Помимо РМА ставят обычные РА, РСК и РИФ по общепринятым методикам.

Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: готовят из 7...10-суточной культуры лептоспир, консервированных 5%-м раствором карболовой кислоты.

Поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: получают методом гипериммунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов 6 серогрупп.

Антигены для диагностики лептоспироза в реакции макроагглютинации: готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выращенные культуры инактивируют формалином, концентрируют, расфасовывают по ампулам и подвергают сублимационному высушиванию.

Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микроагглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

1.2 КАМПИЛОБАКТЕРИОЗ - инфекционная болезнь крупного рогатого скота, овец, свиней, могут поражаться и куры. У млекопитающих отмечают аборты, временное бесплодие, задержание последа, вагиниты, метриты, рождение нежизнеспособного молодняка; у кур – снижение прироста массы бройлеров, яйценоскости кур-несушек и падеж цыплят.

Возбудитель кампилобактериоза относится к семейству Spirillaceae, роду Campylobacter

Морфология (микроскопия). Представители рода Campylobacter - грамотрицательные полиморфные тонкие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завитками, или 5- образные. Средние размеры (0,5...8) х (0,2...0,8) мкм. Подвижны за счет дного полярного жгутика на одном или обоих концах клетки; движение винтообразное. Спор и капсул не образуют.

В мазках от животных, подвергавшихся лечению, располагаются в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокковидных форм.

Материал для исследования. В лабораторию направляют абортированный плод целиком с плодными оболочками или от крупных плодов голову, желудок, легкие, печень; у абортировавших животных -плаценту, слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые 3...4 сут. после аборта или в период охоты; от быков-производителей — препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагностической целью животных — матку, влагалище, лимфоузлы тазовой области.

Лабораторная диагностика включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим свойствам.

Культурально-биохимические свойства. Возбудитель - микроаэрофил; температурный оптимум роста 37...38°С. Для получения культуры кампилобактерий используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2...3 %-й МППА и полужидкий 0,2 %-й мясопеченочный пептонный агар (ПЖА), среду Китта—Тароцци без масла, агар Мартена, сафранино-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в питательные среды добавляют 5... 10 % дефибринированной крови крупного рогатого скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Культивируют

в течение 6...10сут. в микроаэрофильных условиях при замене 10... 15 % воздуха оксидом углерода. Контаминированный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар - 0,5 мл, 2 %-й раствор сульфата железа - 5 мл, 0,5 %-й водный раствор сафранина Т — 5 мл и 0,2 %-й водный раствор новобиоцина - 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют 25 мин при 115°С. Готовая к использованию среда должна быть розового цвета; рН 6,8. При культивировании на данной среде кампилобактерий ее цвет не изменяется, другой микрофлоры — приобретает ярко-желтую окраску.

Каждую пробу высевают, растирая шпателем по поверхности среды, в нескольких чашках Петри. Выросшие колонии пересевают на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китга—Тароцци для получения чистой культуры.

При первичном выделении на плотной среде кампилобактерий образуют через 3...4 сут колонии (гладкие, бесцветные, диаметром 1 мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до 2 мм в диаметре, или плоские, серые или светло-коричневые с неровными краями); редко в виде тонкого налета. На кровяном агаре гемолиз отсутствует. При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с образованием незначительного рыхлого осадка. На полужидком агаре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.

У выделенных культур кампилобактерий изучают ферментативную активность, ростовые потребности и на основании полученных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, биовара.

Серологическая идентификация. Для серодиагностики кампилобактерий выпускают агглютинирующие и люминесцирующие сыворотки против C.fetus sb. fetus (первый тип), С. fetus venerealis (второй тип), С. sputorum bubulus (третий тип).

Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя указанные сыворотки, разведенные 1:50.

Для окончательной серологической идентификации кампилобактерий ставят пробирочную РА. Для этого готовят последовательные разведения каждой из трех моноспецифических сывороток в 3 %-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формалина, — 1: 25, 1: 50, 1:100, 1:200. Затем в каждую пробирку с указанными разведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов концентрацией 1 -109. После внесения компонентов пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37°С) до следующего дня. Затем их выдерживают 3...4 ч при комнатной температуре и учитывают результаты реакции. При положительной реакции с моноспецифической сывороткой одного типа и отрицательной с моноспецифическими сыворотками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.

При получении положительной реакции с двумя моноспецифическими сыворотками (что может быть при выделении атипичных или диссоциированных штаммов) опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими исследуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведения, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принадлежность исследуемого штамма устанавливают по той моноспецифической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспензию в более высоком титре.

Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реакции иммунофлуоресценции используют как чистые, так и смешанные культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.

Биопроба. Нативным материалом или выделенной культурой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течение 10...12 сут. аборт отсутствует, то морских свинок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и овцах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортируют, а при отсутствии аборта их убивают с диагностической целью.

Серологическая диагностика. Основана у коров на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец - РА с сывороткой крови.

Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в пробирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида натрия. Выдерживают 12...14ч. Тампон отжимают, жидкость центрифугируют при 2500...3000 мин - в течение 30 мин.

После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом вагинальной слизи в четырех двукратных разведениях. Для приготовления кампилобактериозного антигена исходную концентрированную суспензию бактерий разводят физиологическим раствором, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1:10.

Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена:

1) контроль антигена (проверка самоагглютинации) — в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добавляют 0,5 мл 3 %-го формалинизированного раствора хлорида натрия; 2) контроль активности антигена: в каждую пробирку с разведенной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специфичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нормальной сыворотки в разведениях 1: 100 и 1:200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрицательная реакция в 1-м и 3-м контролях при положительной во 2-м свидетельствует о правильности постановки реакции.

Учет результатов: 1) положительная — реакция хорошо выражена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная — агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, разводят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положительным, если исследуемая сыворотка дает реакцию агглютинации в разведении 1: 200 и выше на четыре или три креста, сомнительным — на четыре или три креста в разведении 1:100 либо на два или один крест в разведении 1:200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1:100. Сыворотку овец, вакцинированных против кампилобактериоза, серологически не исследуют.

Кроме РА сыворотку животных можно исследовать в РСК, реакции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Для выявления антител в РНГА разработаны экспериментальные партии диагностикумов, которые используют для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Биопрепараты. Инактивированная эмульгированная вакцина против кампилобактериоза овец. Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки. Кампилобактериозный антиген представляет собой инактивированную 0,3 %-м раствором формалина суспензию кампилобактерий.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 358 | Нарушение авторских прав