АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Биотехнологическое производство рибофлавина

Продуценты. При промышленном получении рибофлавина используют культуры дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii, Ashbya gossipii, Candida famata Candida flaveri, синтезирующих до 10 г/л рибофлавина соответственно. Серьезным недостатком этих культур является их нестабильность при хранении на твердых средах во всем диапазоне температур - от комнатной до температуры лиофилизации, в результате чего они теряют способность к сверхсинтезу рибофлавина.

Мутанты-сверхпродуценты рибофлавина получают путем выращивания штаммов на специальной культуральной среде с флавиновыми нуклеотидами, нарушающими ретроингибирование синтеза витамина В2. Отбор ведут по устойчивости к аналогу В2 розеофлавину. Посевной материал, споры гриба Eremothecium ashbyii, выращивают на твердом субстрате - пшене (7 - 8 дней при 29 - 30 °С). После стерилизации жидкий посевной материал подается в ферментер.

Питательная среда. В состав питательной среды для роста продуцентов витамина В2 входят соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях - ферментере и посевном аппарате (инокуляторе).

Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 - 30 °С. По завершении ферментации культуральную жидкость концентрируют (упаривают в вакууме) и высушивают на распылительной сушке.

Немецкий химический концерн BASF построил в Южной коре завод, специализирующийся на производстве рибофлавина с использованием гриба Ashbya gossypii, его также называют Eremothecium gossypii. Концентрация рибофлавина в их промышленных штаммах столь высока, что мицелий гриба красно-коричневый. Рибофлавин накапливается в вакуолях, и его кристаллы иногда разрушают мицелий.

В настоящее время вместе с вышеуказанными культурами при промышленном получении рибофлавина используется мутантный штамм продуцент Васillus subtilis с нарушенной регуляцией синтеза витамина В2. Этот штамм устойчив к наиболее сильному антиметаболиту рибофлавина — его аминоаналогу розеофлавину и обладает способностью к сверхсинтезу витамина В2. При культивировании его на среде с мелассой и дрожжевым экстрактом в культуральной жидкости накапливается 3,5 — 4,5 г/л рибофлавина. При этом время ферментации сократилось в 3 раза.

Рибофлавин получают и химическим методом, используя в качестве биокатализатора сухие клетки бревибактерий. Причем, если биосинтез с нативными клетками занимает несколько суток, то при биосинтезе с суспензией сухих клеток время синтеза ФАД составляет всего 15—17 ч.

Витамин В12.

Биологическая роль. Витамин В₁₂ - водорастворимый витамин, играет важную роль в функционировании мозга и нервной системы, участвует в образовании клеток крови. Регулирует синтез и процессинг ДНК, жирных кислот, энергетический обмен. Добавление витамина к кормам способствует более полноценному усвоению растительных белков и повышает продуктивность сельскохозяйственных животных на 10 - 15%.

Описание. Витамин B12 (Цианокобаламин) - кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Трудно растворим в воде, растворим в этаноле.

Молекула цианокобаламина (рис. 2) содержит кобальт-корриновую систему, в которой ион кобальта (Со³⁺) связан с макроциклом сильно напоминающим порфириновое ядро гема, который и обуславливает окраску витамина. Вторая кольцевая структура - азотистое основание — 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ). 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ N-гликозидной связью.

Рис. 2. Химическая структура витамина В12.

Витамин В12 химически наиболее сложный и объемный витамин, открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. Роберт Вудворд (США, Бостон) и Альберт Эшенмозер (Германия, Цюрих) опубликовали работу по синтезу В12. Вудворд с командой из почти 100 студентов и аспирантов с начала 1960-х годов трудились над синтезом этой молекулы. Синтез включал почти 100 стадий, каждая из которых тщательно планировалась и анализировалась, что было характерно для всех работ Роберта Вудворда. И хотя Вудворд показал, что синтез любого сложного вещества возможен при достаточном времени и разумном планировании, в настоящее время витамин В12 получается только биотехнологическим методом.

Мировое производство витамина В12 сосредоточено в четырех компаниях. Французская компания Sanofi-Aventis и три китайских производителя продают до 35 тонн витамина в год.

Продуценты: В настоящее время основными продуцентами витамина В12 являются Pseudomonas denitrificans and Propionibacterium shermanii, а также актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли, пропионовокислые бактерии (14 видов). Ранее использовался Streptomyces griseus. Во всех случаях независимо от используемого штамма и условий культивирования в среду вводят ионы кобальта и часто 5,6 ДМБ.

Получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В₁₂ используют Prop. Shermanii, их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6-диметилбензимидазола (5,6 ДМБ). Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ. При этом стимулируется наработка витамина. Без 5,6-ДМБ синтезируется псевдокобаламин, содержащий азотистое основание аденин. Если бактерии не синтезируют 5,6-ДМБ, его добавляют на второй стадии ферментации.

Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно отделить центрифугированием и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида.

Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также нитрат кобальта (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно.

Условия культивирования. Бактерии культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5 - 7,0. В процессе ферментации образуются органические кислоты, их нейтрализуют, добавляя аммиак. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением азота и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м³/ч) и перемешивание.

Возможны некоторые вариации в культивировании. Если бактерии не синтезируют 5,6 ДМБ, их культивируют в строго анаэробных условиях без доступа кислорода около 72 ч. Далее через 3 суток в среду добавляют предшественник витамина 5,6-диметилбензимидазол и продолжают ферментацию еще 3 суток. Общая продолжительность ферментации -6 суток

Выделение витамина В12.

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому необходимы операции по выделению витамина. Проводят сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5—5,0 и температуре 85—90°С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка – FeCl₃ и Al₂(SO₄)₃ с последующим фильтрованием, фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионнообменную хроматографию, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3 - 4°С из водно-ацетонового раствора.

Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукты которые сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.

При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина B12, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).

Выход витамина B₁₂ при использовании пропионовокислых бактерий – до 60 мг/л.

Основными направлениями совершенствования штаммов микроорганизмов-продуцентов цианокобаламина являются: увеличение продуктивности штаммов микроорганизмов методами мутагенеза и селекции; увеличение продуктивности штаммов микроорганизмов методом слияния протопластов; увеличение продуктивности штаммов-продуцентов методом генной инженерии; создание штаммов-продуцентов, секретирующих витамин в культуральную жидкость; создание штаммов-продуцентов, растущих на средах из непищевого сырья.

Дата добавления: 2015-11-25 | Просмотры: 5449 | Нарушение авторских прав