АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Научный руководитель: заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, к.м.н., доцент, Тапальский Д.В.

ПОИСК И АДАПТАЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ, ЭФФЕКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ СУПЕРАНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIA – ПРОДУЦЕНТОВ КАРБАПЕНЕМАЗ

УО «Гомельский государственный медицинский университет», г.Гомель, Беларусь

Важинская В.В., Прядко А.О.

Научный руководитель: заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, к.м.н., доцент, Тапальский Д.В.

Введение. Последнее десятилетие характеризуется увеличением устойчивости грамотрицательных бактерийпрактически ко всем антибактериальным препаратам. Одними из наиболее эффективных препаратов для лечения тяжелых нозокомиальных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, являются карбапенемы. Формирование устойчивости к карбапенемам у энтеробактерийможет быть связано с различными механизмами, однако наибольшее клиническое и эпидемиологическое значение имеет продукция приобретенных карбапенемаз. Опасность этих ферментов обусловлена их широким спектром каталитической активности и способностью к быстрому горизонтальному распространению в бактериальных популяциях. Карапенемаза NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase) была впервые идентифицирована в 2008 г. у карбапенем-устойчивого штамма K. pneumonia. В настоящее время отмечается ее быстрое международное распространение на всех континентах. Карбапенемаза OXA-48 изначально была выявлена у карбапенем-устойчивого штамма K. pneumonia в Турции. За последние несколько лет фермент был выявлен у множества других энтеробактерий и успешно распространился за пределы Турции (имеются сообщения о появлении OXA-48 в Средней Азии, Северной Африке. Европе и наиболее часто в США). В отношении многих карбапенемрезистентных нозокомиальных изолятов грамотрицательных бактерий в настоящее время микробиологическую эффективность сохраняют только полимиксины.

В условиях быстрого распространения антибиотикорезистентности среди бактерий альтернативой этиотропной терапии антибактериальными химиопрепаратами может стать использование бактериофагов. Фаготерапия может проводиться как монотерапия, так и в сочетании с антибиотиками в комбинированной терапии инфекций, вызванных суперрезистентными бактериями.

Бактерифаги K.pneumoniae обладают способностью спонтанно адаптироваться к исходно нечувствительным к ним штаммам. Процесс спонтанной адаптации в лабораторных условиях является длительным (занимает от 2 до 6 недель) и недостаточно эффективным. Для ускорения и повышения эффективности процесса адаптации нами предложен метод ускоренного мутагенеза, основанный на культивировании адаптируемого бактериофага в смеси из целевых микроорганизмов, к которым выполняется адаптация, и фагочувствительных микроорганизмов-гипермутаторов, относящихся к тому же виду.

Цель: Оценить фагочувствительность суперантибиотикорезистентных изолятов K.pneumoniae к препаратам бактериофагов и провести адаптацию имеющихся бактериофагов к исходно фагорезистентным изолятам клебсиелл.

Материалы и методы: В исследование включены 54 изолята K.pneumoniae с множественной устойчивостью к антибиотикам, выделенные из клинического материала от больных в Гомеле, Могилеве, Минске, Смоленске, Санкт-Петербурге и Краснодаре.

Первичная идентификация изолятов выполнена в локальных микробиологических лабораториях с использованием ручных коммерческих тест-систем API 20E, а также с использованием автоматических микробиологических анализаторов VITEK 2 Compact на идентификационных картах VITEK 2 GN (bioMérieux, Франция). Реидентификация изолятов выполнена методом матричной лазерной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI – TOF) на анализаторе VITEK MS (bioMérieux, Франция). Анализ чувствительности к восьми антибиотикам (ампициллину, амоксициллину-клавуланат, азтреонаму, цефотаксиму, имипенему, меропенему, ципрофлоксацину, амикацину) проводился диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтона. Методом ПЦР в реальном времени с использованием наборов «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL» и «АмплиСенс MDR MBL-FL» (АмплиСенс, Россия) выполнена детекция генов карбапенемаз.

Чувствительность к препаратам бактериофагов производства НПО «Микроген» («Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», г. Уфа, «Секстфаг», г.Пермь) и бактериофагам клебсиелл, выделенным во внешней среде в г. Гомеле (фаг I, фаг II) определялась капельным методом (спот-тест) на агаре Мюллера-Хинтона. Учет степени лизиса выполняли по четырехкрестной системе. Результаты от 3+ до 4+ учитывали как положительные реакции. Исследование выполняли в 2 повторах.

Для проведения адаптации бактериофагов к фагорезистентным изолятам клебсиелл в стерильных флаконах готовили смесь из 100 мл триптиказно-соевого бульона, фагорезистентных исследуемых изолятов и фагочувствительных изолятов-гипермутаторов K.pneumoniae K-77_mut и K.pneumoniae K-101_mut (конечная концентрация каждого изолята в смеси 10⁶ клеток/мл). В качестве контролей готовились смеси, содержащие только фагорезистентные изоляты без внесения гипермутаторов.

Во все флаконы вносили препараты бактериофагов («Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», фаг I, фаг II) и выполняли инкубацию при постоянном встряхивании на шейкере при 35°С в течение 24 ч. Полученные фаголизаты центрифугировали в режиме 5000 rpm - 10 мин, и выполняли стерилизующую фильтрацию супернатантов (фильтры SARSTEDT Filtopur S0,45). Для учета эффективности выполненной адаптации повторно ставился спот-тест для каждого фаголизата в отношении каждого исходно фагорезистентного изолята, исследование выполняли в 2 повторах.

Результаты исследования и их обсуждение. Для всех изолятов клебсиелл выявлена устойчивость к 6-8 антибактериальным препаратам, 21 изолят (38,9%) был устойчив ко всем тестируемым антибиотикам, включая карбапенемы. Наличие гена карбапенемазы NDM выявлено у 10 изолятов (18,5%), ген карбапенемазы OXA-48 выявлен у 7 изолятов (13,0%). Изоляты с подтвержденной в ПЦР продукцией карбапенемаз имели устойчивость ко всем тестируемым антибиотикам.

К «Бактериофагу клебсиелл поливалентному очищенному» были чувствительны 9 изолятов (16,7%), к препарату «Секстфаг» - 7 изолятов (13,0%), к бактериофагу «Фаг I» (ГГМУ) – 23 изолята (42,6%), к бактериофагу «Фаг II» (ГГМУ) – 35 изолятов (64,8%).

11 изолятов клебсиелл (20,4%) не лизировались ни одним из имеющихся препаратов, 9 из них (в том числе 4 изолята с карбапенемазой NDM) были отобраны для дальнейшего эксперимента по адаптации бактериофагов к исходно фагорезистентным культурам.

По результатам повторно проведенных спот-тестов выявлено, что спонтанно адаптация бактериофагов произошла для 3 из 9 исходно фагорезистентных изолятов (эффективность 33%). При добавлении в смесь фагочувствительных клебсиелл с гипермутаторным фенотипом удалось выполнить адаптацию бактериофагов к 6 из 9 исходно фагорезистентных изолятов (эффективность 67%), для большинства из них в спот-тесте отмечен полный лизис (4+). Методом ускоренного мутагенеза с участием штаммов гипермутаторов удалось выполнить адаптацию бактериофагов ко всем исходно фагорезистентным изолятом K.pneumoniae, продуцирующим карбапенемазу NDM и имеющим полную антибиотикорезистентность.

Выводы. Для лечения инфекций, вызванных суперантибиотикоустойчивыми штаммами K.pneumoniae – продуцентами карбапенемаз в качестве альтернативы может использоваться фаготерапия. Важным условием ее эффективного проведения является предварительное определение фагочувствительности возбудителя. Метод ускоренного мутагенеза с использованием штаммов–гипермутаторов позволяет проводить эффективную адаптацию имеющихся бактериофагов к исходно фагорезистентным изолятам клебсиелл с полной устойчивостью к антибиотикам.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 517 | Нарушение авторских прав