АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Использование культуры клеток.

Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).

 

Типы культур клеток.

 

Тип клеток   Свойства   Частично Трипсинизированные   Перевиваемые   Диплоидные
  Происхождение     Из органов   Из первичных   Из первичных
  Продолжительность жизни       3-5 пассажей   Неограниченное количество пассажей     Около 50 пассажей: - гибель - перевивание
  Кариотип     2n   Xn   2n  
  Способность образовывать опухоли       -     +     -

 

Этапы получения первичной культуры.

 

1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).

2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.

3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.

4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.

5. Проводят дробную трипсинизацию.

6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.

7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.

8. Клетки помещают в питательную среду:

- среда 199

- среда Игла

- среда гидролизатлактальбумина.

9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева

10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.

11. Добавляют 10% сыворотки КРС.

12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.

13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.

 

Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)

 

Используемые растворы.

1. раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)

2. раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.

3. Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.

4. Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.

 

Используемые среды.

1. Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.

2. Среда Игла (Eagle)

3. Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.

 

Заражение культуры клеток.

 

1. С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.

2. Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.

3. Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.

4. Помещают в термостат (30-60 минут)

5. Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.

6. Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.

 

Методу обнаружения вируса в культуре клеток.

 

ЦПД – цитопатическое действие.

1. Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.

2. Гибель клетки с фрагментацией.

3. Образование симпластов.

 

 

Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.

 

При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.

 

Серологические реакции.

 

Дата добавления: 2016-03-26 | Просмотры: 309 | Нарушение авторских прав


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.002 сек.)