АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Процедура трансформации

1. Возьмите две закрытые микроцентрифужные пробирки. Напишите на одной микроцентрифужной пробирке +pGLO, на другой –pGLO, а также ваш класс и фамилию. Поставьте пробирки в штатив.

1. Откройте пробирки и чистой одноразовой пипеткой добавьте по 250 мкл раствора для трансформации (CaCl₂) в каждую пробирку.

1. Поставьте пробирки на лед

1. С помощью стерильной петли, возьмите 2-4 крупных колонии с вашей «стартовой» чашки. Важно выбирать именно отдельные колонии, так как для успеха трансформации клетки должны активно расти. Возьмите пробирку «+pGLO» и погрузите петлю в трансформационный раствор на дне пробирки. Покрутите петлю между большим и указательным пальцами, чтобы вся колония равномерно размешалась в буфере (без плавающих комков). Поставьте пробирку обратно на лед. Возьмите новую петлю и повторите процедуру для пробирки «-pGLO»

1. Рассмотрите раствор плазмиды pGLO под ультрафиолетом. Запишите ваши наблюдения. Окуните новую стерильную петлю в раствор плазмиды. Выньте петлю. На кольце должна быть натянута пленка плазмиды (как пленка мыльного раствора на кольце, когда вы выдуваете пузыри). Помешайте петлей суспензию клеток в пробирке «+pGLO». (если у вас есть микропипетка, добавьте 10 мкл раствора плазмиды микропипеткой и перемешайте). Закройте пробирку и верните ее обратно на лед. Не добавляйте ДНК в пробирку «-pGLO».- это контроль.

Держите пробирки на льду в течение 10 минут. Убедитесь в том, что вы засунули пробирки достаточно глубоко в штатив, так что их нижняя часть погружена в лед.

1. Пока пробирки стоят на льду, подпишите ваши четыре чашки на нижней стороне (не на крышке) как показано на картинке, т.е.:

обозначьте одну чашку LB/amp «+pGLO», другую – «-pGLO». Обозначьте чашку LB без антибиотика – «-pGLO» и чашку LB/amp/ara – «+pGLO»

1. Тепловой шок. Возьмите штатив с пробирками и быстро перенесите его изо льда на нагретую до 42ºС водяную баню РОВНО на 50 секунд. Убедитесь, что пробирки погружены в воду. Как только 50 секунд пройдут, поставьте штатив обратно на лед. Для хороших результатов важно быстро переместить пробирки изо льда (0ºС) на водяную баню (42ºС) и потом обратно на лед (0ºС). Подержите пробирки на льду две минуты.

1. Снимите штатив со льда и поставьте на стол. Откройте первую пробирку, возьмите чистую стерильную пипетку и добавьте 250 мкл питательной среды LB в пробирку. Снова закройте ее. Повторите процедуру для второй пробирки, обязательно взяв новую стерильную пипетку. Перемешайте суспензию и оставьте на 10 мин на столе.

1. Легко встряхните пробирки пальцем, чтобы перемешать. Нанесите по 100 мкл суспензии из каждой на чашки, в соответствии с рисунком. Используйте новую стерильную пипетку для каждой пробирки. Сразу же закрывайте чашки, чтобы минимизировать загрязнение. Не держите чашки открытыми!

1. Откройте первую чашку и быстро размажьте суспензию по поверхности чашки с помощью стерильной петли. Не нажимайте сильно на петлю, водите ее легко по поверхности, чтобы не поцарапать агар. Сразу же закройте чашку, чтобы минимизировать загрязнение и переходите к следующей чашке. Используйте новую стерильную петлю для каждой чашки.

1. Сложите ваши чашки в стопку и склейте вместе скотчем. Напишите на дне нижней чашки ваши фамилии и класс, переверните стопку, чтобы образующийся на крышке конденсат не капал на поверхность агара, и поставьте в термостат/оставьте на столе.

Вопросы к уроку 2

1. На какой из засеянных чашек вы ожидаете увидеть бактерий, наиболее похожих на исходные колонии, которые вы брали для трансформации? Объясните ваш ответ

1. На какой чашке (чашках) вы ожидаете найти трансформированные клетки, если такие будут?

1. Какие чашки нужно сравнивать между собой, для того, чтобы определить насколько удалась трансформация? Почему?

1. Что означает понятие «контрольная чашка»? Для чего нужен контроль?

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 547 | Нарушение авторских прав