ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 3
(4 години)
«Методи дослідження лімфоцитів»
Мета роботи: навчитися отримувати лімфоцити з дефібринованої крові; навчитися підраховувати кількість різних субпопуляцій лімфоцитів; навчитися готувати препарати крові для визначення співвідношення Т- та В- лімфоцитів.
План:
1. Загальна характеристика лімфоцитів та їх субпопуляцій.
2. Маркери Т-лімфоцитів, визначення Т-клітин та їх субпопуляцій.
3. Т-клітинний рецептор і пов’язані з ним структури.
4. Генез Т-лімфоцитів.
5. Формування субпопуляцій Т-клітин.
6. Рецептор В-клітин для розпізнавання антигену. Його будова.
7. Генез В-лімфоцитів.
8. Субпопуляції В-лімфоцитів, їх маркери, функції.
Матеріали та обладнання: світловий мікроскоп, імерсійне масло, знежирені предметні скельця, дефібринована кров людини або лабораторних тварин, порошок фіколу, 60% або 76% розчин верографіну, розчин фікол-урографіну з питомою густиною р = 1,077 г/мл; бараняча кров (еритроцити барана), розчин Хенкса, середовище 199, гемолітична сироватка, мишача сироватка, Т- та В-системи, фарба Романовского-Гімзе, 0,9%-ий розчин NaCl, етиловий спирт; стерильні пластикові або скляні пробірки об’ємом 1 – 2 мм3; центрифуга, центрифужні пробірки, зрівноважувачі для пробірок, пастерки, гумові груші №1, (або готові препарати для підрахунку Т- та В-лімфоцитів).
Завдання на виконання:
1. Самостійно виділити лімфоцити з периферійної крові в градієнті густин фікол-верографіну (центрифугування, 1500 об/хв, 15 – 20 хв):
1.1. В чисту пробірку №1 наливають 1 мл гепаринізованої крові і додають 3 мл фізіологічного розчину.
1.2. В пробірку №2 наливають 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл). Обережно, по внутрішній стороні пробірки пастеркою з грушею додають 2,5 – 3 мл розведеної крові з пробірки №1.
1.3. Кров центрифугують упродовж 20 хв за кімнатної температури при 1500 об/хв.
1.4. Після центрифугування в пробірці спостерігають чотири фракції (Рис.3.1): І – уламки клітин і еритроцити; ІІ – градієнт густини фікол-верографіну; ІІІ – лімфоцити; ІV – плазма крові.
2. Обережно підвести кінчик пастерки до шару лімфоїдних клітин і за допомогою гумової груші відібрати ці клітини і перенести їх в стерильну пробірку.
3. Клітини відмити в середовищі 199 за допомогою центрифугування (центрифугування 1500 об/хв, 5 – 7 хв).
4. Після центрифугування надосадову рідину злити, до осаду додати 0,5 – 1 мл середовища 199, осад ресуспендувати.
5. Одержану суміш лімфоцитів розділити на кілька проб у різні пробірки, додати Т-систему (проба №3) та В-систему (проба №4).
6. Проби №3 з Т-лімфоцитами (Т-системою) струшують та ставлять на 30 хв у термостат за 37°С, потім на 1 год у холодильник за температури 6 – 8°С. Виймають з холодильника, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.
7. Проби №4 з В-лімфоцитами (В-системою) струшують та ставлять на 15 хв у термостат за 37°С. Виймають з термостата, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.
8. Провести фарбування мазків крові (Лаб. роб. №2):
Спосіб №1. На мазок крові наносять фарбу-фіксатор Мая-Грюнвальда на 3 хв; фарбу змивають дистильованою водою; потім на мазок наносять розведену фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2) на 20 хв; мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.
Спосіб №2. На мазок крові наносять етиловий спирт на 20 – 25 хв до випаровування фіксатора; зафіксовані мазки забарвлюють упродовж 20 хв фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2); мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.
9. Підрахувати формені елементи крові у мазках за допомогою світлового мікроскопу (´90) з імерсією: визначити відсоток лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів (закінчення Лаб. роботи №2).
10. Порівняти одержані значення кількості клітин зі значення нормальних показників крові здорової людини або тварин.
10.1. Показники складу крові щурів:
Таблиця 3.1.
Дата добавления: 2015-10-19 | Просмотры: 319 | Нарушение авторских прав
|