АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практическая часть. Споры преломляют свет и четко видны в световом микроскопе

Споры преломляют свет и четко видны в световом микроскопе. Эндоспоры хорошо просматриваются в клетках с помощью све­тового пли электронного микроскопа. Поскольку споры практи­чески непроницаемы для многих видов красителей, они наблюда­ются как неокрашенные тельца на фоне прокрашенного осталь­ного содержимого клетки.

Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Для обнаружения способности клеток к споро­образованию лучше использовать старые культуры. Споры мож­но обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае выявления у микроорганизма способности к образованию спор необходимо обратить внимание на тип спорообразования (бацил­лярный, клостридиальный, плектридиальный), расположение спо­ры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное), форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и опреде­лить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2—3-суточ-ной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития — от веге­тативной клетки до свободной споры.

Наблюдение спорообразования в микрокультуре. На стериль­ном предметном стекле, как описано выше, получают тонкую пленку агаризованной питательной среды, благоприятной для спорообразования (например, картофельного агара). В центр пленки наносят петлей каплю жидкой 24-часовой культуры Bacil­lus megaterium или другой крупной спорообразующей бактерии. Полученный препарат инкубируют при 37° во влажной камере в течение 20—24 ч. Перед микроскопированием препарат подкра­шивают метиленовым синим по Леффлеру и осторожно наклады­вают покровное стекло. Микроскопируют с иммерсией или фазо­вым контрастом. Просматривают край колонии, обращая внима­ние на расположение клеток и на клетки в разных стадиях споро­образования.

Наблюдение живых клеток. Споры по сравнению с цитоплаз­мой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид, светлых включений на фоне почти черных клеток.

Метод выявления спор негативным окрашиванием. На пред­метном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бак­терий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на 3—5 мин наносят метиленовый синий или на 1—3 мин фуксин, после чего препарат осторожно промывают водой и подсушивают на воздухе. Просматривают с иммерсией. Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры, имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку — нет. Они видны как сильно преломляющие свет сферические или овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий. Метод удобен при количественной оценке процесса спорооб­разования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных условиях роста бактерий.

Дифференциальная окраска споры и цитоплазмы по методу Пешкова. Споры и цитоплазму окрашивают при нагревании. Про­мывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель.

На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высуши­вают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продол­жительность окраски, считая с момента закипания красителя,— 10—20 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщатель­но промывают водой, после чего клетки в течение 30 с докраши­вают 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного или сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окра­шивании клетки имеют красный, а споры — синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать малахитовый зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, за­ливают на 7—10 мин 7,5%-ным раствором малахитового зеленого.

Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над со­судом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат во­дой и докрашивают клетки 0,25%-ным водным раствором сафра­нина в течение 1—2 мин. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки — в розовый.

Контрольные вопросы

1. Дайте определение понятиям «покоящиеся формы» и «спора», приведите примеры спорообразующих бактерии;

2. Расскажите строение споры и процесс спорообразования;

3. Какие виды покоящихся форм вы знаете?

4. Расскажите о методе прижизненного наблюдения спорообразования;

5. Расскажите о методах выявления спор в фиксированных препаратах.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 797 | Нарушение авторских прав