АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практическая часть. Гранулы углеводной природы (полисахариды) выявляют при обработке клеток раствором Люголя

Гранулы углеводной природы (полисахариды) выявляют при обработке клеток раствором Люголя. Для этого к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гра­нулы крахмалоподобных веществ — гранулезы — окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов — в крас­новато-коричневый цвет. Гликоген при окраске Люголем легко выявляется у дрожжей, гранулеза характерна для бактерий рода Clostridium. Реакция на гликоген хорошо идет только в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют.

Липидные гранулы. У дрожжей и мицелиальных грибов запас­ные липиды представлены нейтральными жирами, которые легко обнаруживаются в живых клетках без специальных методов ок­раски в виде сильно преломляющих свет капель. Бактерии в каче­стве резервных липидов образуют поли-β-оксимасляную кислоту. Гранулы поли-β-оксибутирата хорошо заметны при микроскопировании живых бактериальных клеток с фазово-контрастным уст­ройством, однако чаще для их выявления клетки окрашивают липофильными красителями — Суданом III или Суданом черным. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фик­сируют в пламени горелки. Заливают поверхность мазка раство­ром Судана черного и оставляют краситель на 5—15 мин. Избы­ток красителя сливают, просушивают препарат фильтровальной бумагой, просветляют в ксилоле, погружая в него несколько раз предметное стекло. Время просветления препарата не должно пре­вышать 1 мин. После этого клетки дополнительно окрашивают в течение 10 с 0,1%-ным водным раствором сафранина. Более дли­тельная обработка сафранином нежелательна, так как маскиру­ется основная окраска. Гранулы поли-β-оксибутирата окрашива­ются в темный цвет, остальная часть клетки — в розовый.

Полифосфаты (волютин и метахроматин). В клетках про­кариот волютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот — в вакуолях. Окраска волютиновых гранул основана на свойстве метахромазии — способности вызывать изменение цвета некото­рых красителей (метиленовый синий, толуидиновый синий). Го­товят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фикси­руют в пламени горелки. На фиксированный мазок наливают ме­тиленовый синий по Леффлеру и окрашивают клетки в течение 10 мин. Краситель сливают, препарат промывают водой, высуши­вают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки окра­шиваются в голубой цвет, а зерна волютина — в фиолетово-красный. Волютин легко выявить окраской по способу Омелянского, основанному на плохой растворимости волютина в растворах кис­лот. В этом случае на фиксированный в пламени горелки мазок наливают карболовый фуксин Циля и окрашивают клетки в течение 0,5—1,0 мин. Краску сливают, промывают препарат водой и обесцвечивают 1 %-ным раствором H₂S0₄ в течение 20—30 с. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и дополнительно ок­рашивают 20—30 с метиленовым синим (1:40) Снова промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют с иммерсион­ной системой. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы

Для выявления волютина у дрожжей применяют следующий способ. Фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение 3 мин. Краситель слива­ют, препарат промывают водой и, не высушивая, наносят на мазок небольшую каплю 1%-ного раствора серной икислоты; мазок нак­рывают покровным стеклом и микроскопируют. Волютин имеет вид капель сине-фиолетового цвета на слабо-голубом фоне цитоплаз­мы.

Включения серы встречаются только у некоторых бактерий. Благодаря двойному лучепреломлению капли серы хорошо замет­ны в клетках без специального окрашивания. Включения серы растворяются при обработке клеток абсолютным спиртом, сероуг­леродом или ледяной уксусной кислотой.

Параспоральные тельца. Спорулирующая клетка Bacillus thuringiensis образует примыкающий к споре правильный бипирамидальный белковый кристалл, который высвобождается вместе со спорой при автолизе материнской клетки. Для обнаружения параспоральных телец применяют специальную окраску. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и в течение 2 мин окрашивают анилиновым черным. Затем осторожно смывают краску водой и мазок в течение 15 с докрашивают фуксином Циля. Препарат промывают во­дой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильной окраске кристаллы белка (параспоральные тель­ца) окрашиваются в черный, а остальная часть клетки — в розо­вый цвет. Параспоральные тельца можно наблюдать и в живых клетках, используя фазово-контрастное устройство. В этом слу­чае параспоральные тельца выглядят как гранулы, способные сильно преломлять свет.

Контрольные вопросы

1. Что такое включения запасных веществ?

2. Перечислите виды запасных веществ;

3. Укажите роль каждого включения в метаболизме бактериальной клетки;

4. Перечислите методы выявления и наблюдения внутриклеточных включений.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 784 | Нарушение авторских прав