АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Рестрикция ДНК и ферменты модификации

Практически все виды бактерий синтезируют по одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктазами), поскольку их основная функция состоит, по-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов.

9. Методы работы с ДНК 267

Таблица 9.1. Последовательности, узнаваемые некоторыми рестрикционными эндонукле- азами

1 Звездочками помечены основания, которые могут быть метилированы ферментами модификации. Малыми стрелками указаны разрезы, производимые рестриктазами типа II. Длинная вертикальная линия -ось симметрии. Pu -пурин, Ру- пиримидин. Размеры геномов: SV40-5224 н.п.; λ-48502κ.π.; аденовирус 2-38 200 н.п.

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов.

Рестриктазы второго типа узнают палиндромные последовательности-последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего типа, напротив, узнают асимметричные сайты. В табл. 9.1 представлены сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрел-

268 Организация и передача генетического материала

Таблица 9.2. Характеристика сайтов, узнаваемых рестриктазами
Фермент	Сайт узнавания
Тип Π (Ν = 7)
Ek I
Симметричный (Ν = 6)
Вырожденный симметричный (Ν = 6)
Симметричный (Ν = 5)

9. Методы работы с ДНК 269

	Продолжение табл. 9.2.
Фермент	Сайт узнавания
Симметричный (N = 4)
Симметричный метилированный (N = 4)++
Ассиметричный (N = 5)
1 Для ферментов типа II последовательность представлена лишь в одной цепи; комплементарную последовательность можно достроить. Вертикальная линия обозначает положение, в котором разрываются фосфодиэфирные связи. Звездочки указывают основания, которые могут быть метилированы соответствующими ферментами модификации. 2 Специфический сайт узнавания Dpn Ι содержит метилированный аденин (mА), тогда как сайт Мbо I содержит неметилированное основание. Msp I узнает указанную последовательность независимо от метилированности внутреннего С; Ηρα II, напротив, узнает ту же последовательность лишь в том случае, если внутренний С не метилирован.

ками, точка разреза двойной спирали может совпадать с осью симметрии, а может быть сдвинута относительно нее. В последнем случае образуются комплементарные концы, и между соответствующими основаниями могут сперва устанавливаться водородные связи, а затем посредством ДНКлигазы происходить сшивка фрагментов с возникновением ковалентных связей между соседними нуклеотидами. Защита от повторного расщепления рестриктазой обеспечивается ферментами модификации, метилирую-

270 Организация и передача генетического материам

щими некоторые основания в сайте узнавания: соответствующие основания помечены звездочкой. Метилирование происходит после того, как соответствующий нуклеотид включается в ДНК в процессе репликации. Эти ферменты могут действовать либо на неметилированные, либо на полуметилированные сайты; при этом в процессе полуконсервативной репликации образуются полностью метилированные сайты.

Из различных видов и штаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК in vivo. Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независимо от их функций in vivo служат мощным инструментом структурного анализа геномов.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 816 | Нарушение авторских прав