 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Ярославль – 2007
Научный руководитель доктор медицинских наук ВЕЗИКОВА Наталья Николаевна САТЫБАЛДЫЕВ Азамат Махмудович доктор медицинских наук, профессор ХРУСТАЛЕВ Олег Анатольевич Защита диссертации состоится 15 мая 2007 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.119.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5. Автореферат разослан «» апреля 2007г. Ученый секретарь диссертационного совета ^ Актуальность проблемы Этиология РА достоверно неизвестна, а используемая патогенетическая терапия не оказывает достаточного эффекта у части больных, что определяет необходимость поиска новых подходов к лечению, основанных на данных о патофизиологии процесса (Е.Л. Насонов, 2004, C.M. Weyand, 2000). В настоящее время большое внимание в патогенезе РА уделяется изучению апоптоза – генетически запрограммированной формы гибели клетки, обеспечивающей в организме клеточный гомеостаз (А.А. Ярилин, 1998; А.Н. Богданов, Т.А. Камилова и соавт., 2005; M. Schirmer, A.N. Vallejo et al., 1998; R.M. Pope, 2002). Внимание к апоптозу как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при РА обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. Поражение суставов в виде синовиальной гиперплазии позволяет предполагать нарушения программированной клеточной гибели синовиоцитов, приводящие к формированию паннуса, а местная инфильтрация различными клетками воспаления не исключает дефекты апоптоза лимфоцитов, поддерживающих хроническое течение болезни (А.Н. Богданов, Т.А. Камилова и соавт., 2006; K. Eguchi, 2001; H. Perlman, L.J. Pagliari et al., 2001; R.M. Pope, 2002; K. Itoh, H. Hase et al., 2004). Менее изученным вопросом является процесс программированной клеточной гибели циркулирующих лимфоцитов, нарушение которого может вести к потере иммунологической толерантности в результате увеличения продолжительности жизни и накопления функционально активных аутореактивных Т-клеток (А.Н. Богданов, Т.А. Камилова и соавт., 2005; F.M. Bryl, A.D. Foey et al., 2002). Продолжается изучение роли в нарушениях процесса апоптоза главных его участников – аспартат-специфических протеаз (каспаз (К)), среди которых выделяют активаторы провоспалительных цитокинов, активаторы эффекторных К и эффекторные К – непосредственные исполнители апоптоза (Е.Б. Владимирская, 2002; М.Ю. Григорьев, Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон, 2003; А.А. Фильченков, 2003; J.M. Adams, 2003). Проводятся исследования особенностей функционирования при РА основных регуляторов программированной клеточной гибели, в том числе наиболее изученного индуктора апоптоза Fas-лиганда (FasL), экспрессируемого на активированных Т-лимфоцитах, и его растворимой формы (sFasL) (A.N. Vallejo, M. Schirmer et al., 2000; O. Bohana-Kashtan, C.I. Civin, 2004). Фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α), являющийся одним из основных участников патогенеза РА, в настоящее время рассматривается как регулятор апоптоза с разнонаправленными эффектами от апоптотической гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференцировки (А.А. Ярилин, 1998). Продемонстрировано влияние интерлейкинов (ИЛ) как провоспалительных цитокинов на активность программированной клеточной гибели лимфоцитов синовиальной ткани и периферической крови при РА (K. Eguchi, 2001; H. Perlman, L.J. Pagliari et al., 2001). На основании имеющихся данных последнее время предпринимаются попытки создания препаратов, влияющих на апоптоз, – блокаторов рецепторов, регулирующих программированную клеточную гибель, блокаторов ингибиторов апоптоза и средств, модифицирующих активность К (M.D. Smith, J.G. Walker, 2004; U. Fisher, K. Schulze-Osthoff, 2005). В то же время активация апоптоза считается одним из механизмов патогенетического действия рекомендованных для лечения РА базисных противовоспалительных препаратов (БПВП) (Е.Л. Насонов, 2005; M. Cutolo, A. Sulli et al., 2001). Не исключается возможность прогнозирования эффективности базисных средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели (S. Herman, N. Zurgil et al., 2003). Более активное исследование влияния БПВП на апоптоз поможет объяснить различную чувствительность пациентов к имеющимся лекарственным средствам. Несмотря на признанное участие периферических лимфоцитов в патогенезе РА опубликованные сведения, посвященные нарушениям апоптоза как причине накопления клона аутореактивных Т-клеток, весьма малочисленны. Имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии. С учетом вышеизложенного в работе необходимо продолжить изучение интенсивности апоптоза периферических лимфоцитов при различной активности РА и влияния проводимого лечения на программированную клеточную гибель.
^ Научная новизна работы Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при ревматоидном артрите со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности и активности заболевания. Обнаружена закономерная связь нарушений апоптоза периферических лимфоцитов с активностью ревматоидного артрита. В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной клеточной гибели периферических лимфоцитов на фоне проводимого лечения базисными противовоспалительными препаратами. Выявлено коррегирующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью снижения реализации апоптоза. Впервые оценена возможность использования показателей активности программированной клеточной гибели периферических лимфоцитов в качестве прогностических факторов эффективности лечения базисными противовоспалительными препаратами. ^ Практическая ценность работы
^ Апробация работы В исследуемую группу включены 63 (70%) женщины и 27 (30%) мужчин в возрасте от 20 до 74 лет (средний возраст 49,34±11,63 года). Длительность заболевания составила в среднем 14,26±13,31 месяцев, причем у 87 (96,67%) пациентов РА диагностирован впервые или в предшествующие исследованию 36 месяцев. У всех больных проводилась клиническая оценка общего суставного синдрома (суставной индекс Ричи (СИР), число болезненных суставов (ЧБС), число припухших суставов (ЧПС), утренняя скованность (УС), оценка состояния здоровья и боли пациентом по визуальной аналоговой шкале (ВАШ)) и функционального статуса по вопроснику HAQ. Для определения стадии РА всем больным проводилась рентгенография клинически наиболее пораженных суставов. Общая активность РА оценивалась по индексу DAS4. Пациентам выполнялось исследование гемограммы, определялись уровень общего белка и белковых фракций, фибриногена, С-реактивного белка с помощью высокочувствительного теста (hsСРБ), ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Методом иммуноферментного анализа исследованы на содержание в сыворотке крови ИЛ-2 28 пациентов, ИЛ-6 – 44, ФНО-α – 50, sFasL – 39 больных. Оценка апоптоза циркулирующих лимфоцитов проводилась по активности К4, К6 и К8 через 30, 60, 120, 150 и 180 минут после начала реакции флуоресценции (ФЦ) с использованием специфических субстратов К (для К4 (активатор цитокинов) – WEHD (Trp=Glu=His=Asp), для К8 (активатор эффекторных К) – LETD (Leu=Glu=Thr=Asp), для К6 (эффекторная К) – VEID (Val=Glu=Ile=Asp)) и по выявлению количества 2-нитевых и 1-нитевых разрывов ДНК методом ФЦ ДНК-тропных красителей – этидиума бромида (EtBr) и 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1. Таблица 1 Клиническая характеристика исследуемой группы
Все больные РА были разделены на 3 группы в зависимости от длительности заболевания и особенностей проводимого лечения. Группу впервые диагностированного РА (ВДРА) составили 25 (27,78%) пациентов, которые были включены в исследование сразу после установления диагноза. Больные этой группы имели начальные клинические проявления заболевания длительностью менее 6 месяцев и никогда ранее не получали БПВП. В группу пациентов с ранее диагностированным РА, получающих постоянную базисную терапию (БПБТ) на протяжении 3 и более месяцев перед исследованием, включено 39 (43,33%) больных – в качестве базисного средства использовался главным образом метотрексат в дозе 7,5-20 мг/нед. (в среднем 11,82±3,47 мг/нед.). Группу пациентов с установленным ранее РА, не принимающих базисные препараты (БНБП) по разным причинам более 3 месяцев перед первичным осмотром, составили 26 (28,89%) больных. Общая характеристика групп представлена в таблице 2, клиническая характеристика – в таблице 3. Общая характеристика групп пациентов
Таблица 3 Клиническая характеристика групп пациентов
В качестве группы сравнения обследовано 20 больных ОА с преимущественным поражением коленных суставов. Среди пациентов было 17 (85%) женщин и 3 (15%) мужчин. Средний возраст составил 59,70±10,32 года при средней длительности заболевания 5,80±5,59 года. Показатели активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных РА и ОА оценивались в сравнении с показателями 20 здоровых доноров в возрасте от 17 до 58 лет. Результаты исследования обрабатывались с помощью IBM-совместимого компьютера с процессором Pentium с использованием Microsoft Office Excel 2003 и пакета статистических программ Statistica 6.0. Перед проведением статистического анализа количественные признаки проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для нормально распределенных признаков определялись средние величины и стандартное отклонение (M±s, где М – среднее арифметическое, s – стандартное отклонение), для признаков распределенных отлично от нормального – медиана и интерквартильный размах (A (L-H), где A – медиана, L – нижний квартиль, H – верхний квартиль). Статистический анализ проводился непараметрическими методами – сравнение методами ANOVA Краскела-Уоллиса (для 3 и более независимых групп), Манна-Уитни (для 2 независимых групп), Вилкоксона (для 2 зависимых групп) и анализ корреляции методом Спирмена (О.Ю. Реброва, 2003). Таблица 4 Количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК
отмечена в таблице * при p<0,05, ** при p<0,01 и *** при p<0,001.
Отмечена положительная корреляция уровня К8 с числом припухших суставов (p<0,01), длительностью УС (p<0,05), уровнем hsСРБ (p<0,05), что может отражать индукцию К8 при более высокой активности ревматоидного воспаления. Вместе с тем, количество разрывов ДНК при более высокой активности К8 и К6 оказалось ниже (для 1-нитевых разрывов ДНК коэффициент корреляции (r) от -0,349 до -0,361, p<0,001). Таким образом, при РА отмечено ассоциированное с показателями активности болезни повышение активности К8, тем не менее не реализующееся в полной мере в виде разрывов ДНК. Не отмечено увеличения интенсивности программированной клеточной гибели при более высоких степенях активности РА, как не выявлено зависимости апоптоза от стадии и длительности заболевания (p>0,05). Не выявлено достоверных различий показателей активности программированной клеточной гибели при наличии или отсутствии системных проявлений (p>0,05).
В ходе работы ни один из исследуемых цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α) не продемонстрировал достоверного влияния на активность апоптоза периферических лимфоцитов. ИЛ-6 показал закономерную положительную корреляцию с ФНО-α (r=0,472, p<0,05) и основными острофазовыми показателями (p<0,01). Учитывая, что согласно методике определения у большинства здоровых лиц уровень ИЛ-6 в сыворотке крови ниже порога детекции, а в исследуемой группе больных РА концентрация цитокина не определялась только у 3 (6,82%) пациентов, очевидна его роль как маркера воспалительной реакции. Содержание ИЛ-6 в сыворотке крови у пациентов с системными проявлениями болезни (34,42 (8,23-135,29) пг/мл) по сравнению с группой больных без системных проявлений (6,50 (3,59-18,64) пг/мл) было достоверно выше (p<0,01). sFasL выявлен у 14 (35,9%) из 39 обследованных при отсутствии детектируемых уровней в крови здоровых доноров согласно методике исследования. Не выявлено корреляции показателей активности апоптоза с концентрациями sFasL или различий в группах больных с определяемым уровнем лиганда и концентрациями его ниже 0,1 нг/мл. По результатам сравнительной оценки исходных показателей интенсивности программированной клеточной гибели при сопоставимой активности болезни количество разрывов ДНК у пациентов с впервые диагностированным и ранее установленным РА достоверно не различались. В исследуемой группе на фоне терапии БПВП в течение года отмечено достоверное снижение индекса DAS4 и улучшение функционального статуса по HAQ при повышении количества разрывов ДНК. Результаты отражены на рис.3.
В группе БНБП в течение года также отмечено снижение активности болезни и улучшение функционального статуса, сопровождающееся увеличением количества разрывов ДНК. В группе БПБТ не продемонстрировано существенной динамики индекса DAS4, показателей HAQ и реализации апоптоза (p>0,05). Учитывая, что основную часть обследованных составляли пациенты стационара, можно предположить исходно недостаточный эффект рекомендованных базисных средств или развитие резистентности к ним, послужившие причиной очередной госпитализации.
Проведен анализ динамики активности апоптоза в зависимости от эффективности проводимой терапии, которая оценивалась по критериям ACR и EULAR. Больные с удовлетворительным или хорошим эффектом по критериям EULAR, а также 20%, 50% и 70% улучшением по критериям ACR составили группу «ответчиков». Пациенты, у которых была констатирована неэффективность лечения базисными средствами, вошли в группу «неответчиков». «Ответчики» продемонстрировали тенденцию к росту количества 1-нитевых разрывов ДНК как за счет увеличения активности К, так и за счет более продуктивной реализации имеющейся активности ферментов. В группе «неответчиков» при незначительном повышении количества 1-нитевых разрывов ДНК отмечено достоверное снижение количества 2-нитевых разрывов (p<0,05). Динамика интенсивности ФЦ DAPI представлена на рис.5. Повышение индекса DAS4 к 6 месяцам в группе «неответчиков» сопровождалось увеличением активности К4 при обратной динамике у больных с эффективной терапией БПВП – данные отражены на рис.6.
Для определения прогностической ценности результатов исследования апоптоза было проведено попарное сравнение исходных данных по активности К и количеству разрывов ДНК в группах «неответчиков» и «ответчиков». Результаты анализа не позволяют говорить о прогностической ценности показателей активности программированной клеточной гибели в отношении эффективности проводимой терапии БПВП. Не было выявлено достоверных различий и при сравнении исходных уровней ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α, sFasL (p>0,05). Для оценки влияния метотрексата на активность РА и интенсивность программированной клеточной гибели проведен анализ эффективности лечения у 23 пациентов групп ВДРА и БНБП, начавших терапию препаратом с момента включения в исследование и продолжавших ее в течение всего времени наблюдения без перерывов и смены базисного средства. Динамика основных клинико-лабораторных данных представлена в таблице 5. Таблица 5 Динамика клинико-лабораторных показателей на фоне терапии метотрексатом в течение 1 года
в таблице * при p<0,05, ** при p<0,01 и *** при p<0,001. По результатам анализа исходных показателей интенсивности программированной клеточной гибели периферических лимфоцитов в группах «ответчиков» и «неответчиков» не представляется возможным рассматривать активность К и количество разрывов ДНК как прогностические факторы эффективности терапии метотрексатом.
^ ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
^ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Список сокращений более месяцев перед включением в исследование БПБТ – больные, получающие базисную терапию в течение 3 и более месяцев перед включением в исследование БПВП – базисный противовоспалительный препарат ВАШ – визуальная аналоговая шкала ВДРА – впервые диагностированный ревматоидный артрит ГКС – глюкокортикостероиды ИЛ – интерлейкин К – каспаза ОА – остеоартроз РА – ревматоидный артрит РФ – ревматоидный фактор СИР – суставной индекс Ричи УС – утренняя скованность ФНО-α – фактор некроза опухоли-альфа ФЦ – флуоресценция ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЧБС – число болезненных суставов ЧПС – число припухших суставов ACR – Американская Коллегия ревматологов DAPI – 4’,6-диамидино-2-фенилиндол DAS – индекс активности заболевания EtBr – бромистый этидий EULAR – Европейская противоревматическая Лига FasL – Fas–лиганд hsСРБ – С-реактивный белок, определенный с помощью высокочувствительного теста sFasL – растворимая форма Fas-лиганда соискатель кафедры госпитальной терапии Петрозаводского государственного университета Рябков В.А. Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1028 | Нарушение авторских прав |
Рис.1. Активность К4 в исследуемой группе. Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена ** при p<0,01 и *** при p<0,001.
Рис.2. Активность К8 и К6 в исследуемой группе. Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена ** при p<0,01 и *** при p<0,001.
Рис.3. Динамика индекса DAS4, HAQ и количества 1-нитевых разрывов ДНК в исследуемой группе на фоне терапии БПВП в течение 1 года. Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена * при p<0,05, ** при p<0,01 и *** при p<0,001.
Рис.4. Активность К4 в группе ВДРА на фоне терапии БПВП в течение 1 года. Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена * при p<0,05, ** при p<0,01 и *** при p<0,001.
Рис.5. Динамика количества 1-нитевых разрывов ДНК в зависимости от эффективности терапии БПВП в течение 6 месяцев.
Рис.6. Динамика активности К4 в зависимости от эффективности терапии БПВП в течение 6 месяцев. Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена * при p<0,05, ** при p<0,01 и *** при p<0,001.