АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Физико-химические свойства белков

Физико-химические свойства белков

Первичная структура белков в значительной степени определяет вторичную, третичную структуры и особенности четвертичной структуры. В свою очередь, первичная и пространственная структуры белков, их молекулярная масса, форма и размеры обусловливают их физико-химические свойства.

Молекулярная масса белков достаточно большая, поэтому они относятся к высокомолекулярным соединениям. Молекулярная масса белков колеблется от 6 000 до 1 000 000 Дальтон и выше, она зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков имеющих четвертичную структуру – от количества входящих в них протомеров (субъединиц).

Молекулярная масса некоторых белков составляет: инсулин - 5700Д,

Пепсин- 35 000Д, гемоглобин – 65 000Д.

Молекулярную массу белка можно определить по скорости седиментации при ультрацентрифугировании, т.е. при ускорении 100000-500000 G. На основании этого определяют коэффициент седиментации, который обозначают S (в честь шведского ученого СВЕДБЕРГА). Он предложил за единицу коэффициента седиментации величину 10^-13. Молекулярная масса большинства белков колеблется в пределах 1-20S.

Другим методом определения молекулярной массы является метод гельфильтрации (молекулярное просеивание). Используется искусственно созданные гранулы, имеющие поры (гранулы СЕФАДЕКСА). Внутрь гранулы могут проникать только соединения определённого размера: молекулы небольшого размера входят в гранулы, а большие быстрее вымываются. Молекулярная масса рассчитывается ориентировочно. Буфер не задерживается, а белок движется тем медленнее, чем меньше молекулярная масса.

Белки способны связываться с лигандами.

Белки специфично узнают свои лиганды, что обусловлено комплементарным

строением определенного участка белка и лиганда.

ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ обеспечивается белковой частью гемоглобина. Центр связывания ЛИГАНДА называется активным центром. Это свойство лежит в основе другого метода разделения белков – аффинной хроматографии.

Белки имеют различную форму, но выделяют две основных группы: глобулярные (шарообразные) и фибриллярные (веретенообразные). Глобулярные белки более компактны, в этих белках гидрофильные группы расположены преимущественно снаружи, а гидрофобные – внутри, образуя ядро.

На основе различий белков в молекулярной массе, размеров и форме их можно разделить с помощью ультрацентрифугирования (по скорости седиментации), методом гель – фильтрации (молекулярного просеивания в сефадексе).

Различия в первичной структуре белков, их конфигурации, молекулярной массе, размерах определяют разнообразные свойства белков. Можно выделить несколько групп физико-химических свойств.

Электрохимические свойства белков.

Белки — амфотерные полиэлектролиты, т. е. подобно аминокислотам они обладают кислотными и основными свойствами. Эти свойства белка обусловлены электрохимической природой R-радикалов аминокислот, входящих в состав белка. Поскольку большая часть ионогенных и полярных R-групп находится на по­верхности белковой глобулы, то именно они определяют кислот­но-основные (амфотерные) свойства и заряд белковой молекулы. Кислые свойства белку придают аспарагиновая и глутаминовая аминокислоты, диссоциация их карбоксильных групп является источником отрицательных электрических зарядов на поверхности белковой молекулы. Основные свойства белку придают лизин, аргинин, гистидин, способные к протонированию и к созданию на поверхности белковой молекулы положительных зарядов. В амфотерную природу белковой молекулы вносят вклад (хотя и несущественный) ее N- и С-концевые аминокислоты. Слабая диссоциация SН-групп цистеина и ОН-групп тирозина весьма несущественно влияет на амфотерность белков. В целом, чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем сильнее выражены его кислотные свойства, тем выше суммарная плотность отрицатель­ного заряда, и чем больше основных аминокислот, тем ярче прояв­ляются основные свойства белка и выше плотность положительных зарядов на его молекуле. Однако следует отметить, что значения рК радикалов аминокислот колеблются в довольно широких пределах.

Амфотерная природа белков обусловливает определенную буферность их растворов. Однако при физиологических значениях рН она невелика. Исключение составляют белки, содержащие большое количество гистидина, так как только боковые имидазольные группы гистидина обладают буферными свойствами в ин­тервале значений рН, близких к физиологическим. Таких белков мало; к ним относится, например, гемоглобин животных, содер­жащий 8 % гистидина, обусловливающего высокую внутриклеточ­ную буферность в эритроцитах, поддерживая рН крови на посто­янном уровне.

Суммарный заряд белковой молекулы определяется соотноше­нием в ней кислотных и основных радикалов аминокислот и вели­чиной их рК. Если в белке кислые аминокислоты преобладают над основными, то в целом молекула белка электроотрицательна, т. е. находится в форме полианиона; и наоборот, если преобладают основные аминокислоты — в форме поликатиона.

Амфотерный характер белков особенно ярко проявляется при изменении рН белкового раствора. В кислой среде в результате высокой концентрации Н⁺-ионов идет подавление кислотной диссоциации карбоксильных групп и интенсивное протонирование NH^-₂, —NH—, имидазольных групп — суммарный заряд бел­ковой молекулы будет положителен; в щелочной среде при избыт­ке ОH-ионов будет наблюдаться обратная картина: интенсивная диссоциация карбоксильных групп и депротонирование основных групп — суммарный заряд отрицателен. Естественно, что каждый белок при каком-то определенном значении рН будет иметь сум­марный электрический заряд, равный нулю; такое состояние бел­ка называется изоэлектрическим состоянием, а величина рН, обус­ловливающая это состояние, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В этой точке белок не обладает подвижностью в электри­ческом поле; имеет наименьшую растворимость в воде; белковые растворы обладают минимальной устойчивостью и минимальным осмотическим давлением. ИЭТ каждого белка определяется соот­ношением кислых и основных групп, величиной их рК: чем боль­ше это соотношение и ниже величина рК групп, тем ниже ИЭТ белка. У кислых белков ИЭТ < 7, у нейтральных около 7, а у основ­ных > 7; при рН < ИЭТ белок будет находиться в форме поликати­она, при рН > ИЭТ — в форме полианиона, в ИЭТ — в форме ам-фотерного полииона (цвиттер-полииона). ИЭТ большинства бел­ков клеток животных, растений, микроорганизмов лежит в пределах 5,5—6,0, а внутриклеточная величина рН находится в пределах 7,0—7,2 (физиологическое значение рН). Следовательно, клеточ­ные белки имеют в общем отрицательный заряд, который уравно­вешивается неорганическими катионами.

Поскольку каждый белок в водных или буферных растворах имеет свой суммарный заряд определенной величины, это свой­ство белков нашло широкое применение для их разделения мето­дом электрофореза. Он основан на передвижении заряженной ча­стицы в электрическом поле. Движение частицы происходит в жидкой среде, которая удерживается инертным твердым носите­лем, например полоской бумаги, гелевой пленкой из крахмала, опарой, полиакриламидами, декстраном, ацетатом целлюлозы, что позволяет существенно снизить диффузию фракционируемых белков в отличие от электрофореза в водной среде. Жидкость же служит проводящей средой для электрического поля, когда к ней приложено внешнее напряжение. Подвижность заряженной мо­лекулы в электрическом поле называется электрофоретической подвижностью.

В разделении белков наибольшее распространение получил электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), который при­меняется для разделения, очистки, оценки чистоты и определе­ния молекулярной массы. Гель полиакриламидной матрицы в виде однородного тонкого слоя (а не гранул) можно поместить между двумя пластмассовыми пластинками или же заполнить этим гелем трубочки. Структура полиакриламида сшита попереч­ными связями, благодаря чему этот материал имеет развитую по­ристость.

Коллоидные свойства белков

Водные растворы белков — это устойчивые системы, по этому свойству их можно отнести к истинным молеку­лярным растворам. Однако высокая молекулярная масса белков придает им коллоидный характер.

Как правило, диаметр белковых глобул превышает 0,001 мкм. Молекулы белков не способны диффундировать через полупроницаемые мембра­ны —целло­фан. На этом явлении основана очистка белков от низкомолеку­лярных примесей методом диализа, очистка и концентрирование белков методом ультрафильтрации. При диализе целлофановый мешочек с раствором белка помещают в сосуд с проточной водой. Внешние стенки мешочка омываются водой. Низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану и удаляются вместе с во­дой, а белки остаются. При ультрафильтрации мембрана действует как молекулярный фильтр.

Биологические мембраны живых клеток также непроницаемы для белков. Поэтому содержащиеся в протоплазменных структу­рах этих клеток белки создают в них определенное осмотическое давление, называемое коллоидно-осмотическое или онкотическое давление.

Малой скоростью диффузии обладают белки и в водных раство­рах, она зависит не только от моле­кулярной массы, но и от формы белковой молекулы. Глобулярные белки в водных раство­рах имеют более высокий коэффициент диффу­зии, чем фибриллярные.

Характерными признаками коллоидного харак­тера белковых растворов являются их опалесценция, блеск и способность рассеи­вать лучи света (эффект Тиндаля).

Если через кювету с раствором низкомолекулярного вещества, например NaС1, пропустить пучок света, то в кювете он не будет обнаружен, раствор является «оптически пустым». Иная картина будет наблюдаться в кювете с раствором белка, при боковом осве­щении в ней появляется светящаяся полоса или конус. При прохождении света через раствор, содержащий белковые глобулы, радиус которых на­много превышает длину волны света, будет наблюдаться дифрак­ция света: падая на белковую глобулу, свет будет отражаться в раз­личных направлениях.

Светорассеивающая способность белков может быть использо­вана при определении концентрации белковых растворов методами нефелометрии и турбидиметрии, основанных на сравнении интенсивности светорассеивания этих растворов.

Гидратация белков

Гидратация белков - способность белков связывать воду. 100 г. белка связывает 30-35 г. воды.

. Вода связывается ионогенными группами и пептидными группами, расположенными в основном, внутри молекулы белка. Проникновение воды внутрь молекулы белка называется набуханием. Связывание воды ионогенными группами, расположенными на поверхности белковой молекулы, приводит к образованию гидратной оболочки. Коли­чество связанной воды для различных белков составляет около 35 г на 100 г белка. Связанная вода в гидратной оболочке на­ходится в упорядоченном состоянии, что приводит к уменьшению энтропии при гидратации.

1.3.4 Растворимость белков в воде

Многие белки хорошо растворимы в воде, что определяется количеством полярных групп. Растворимость глобулярных молекул лучше, чем фибриллярных белков. Факторы, определяющие стабильность белковых растворов:

- наличие зарядов в белковой молекуле. Одноименные заряды способствуют растворимости белка, т.к. препятствуют соединению молекул и выпадению в осадок.

- Наличие ГИДРАТНОЙ оболочки, препятствующей объединению белковых молекул. Для осаждения белка, его необходимо лишить этих двух факторов устойчивости. Методом осаждения белка является вливание - осаждение белка с помощью нейтральных солей - (NH4)2-S04.

В полунасыщенном растворе (NH4)2-SO4 осаждаются глобулины, а в насыщенном - альбумины.

После удаления осаждающего фактора, белки переходят в растворённое состояние.

Лабильность пространственной структуры белка.

Под действием внешних факторов может происходить нарушение высших уровней организации белковой молекулы (вторичной, третичной, четвертичной структур) при сохранении первичной структуры. При этом белок теряет свои нативные, физико-химические и биологические свойства. Это явление называется денатурацией. Денатурацию вызывают химические факторы (повышение температуры, давления, механическое воздействие, УЗ, ионизирующее излучение), химические факторы (кислоты, щелочи, органические растворители -спирт, фенол; соли тяжёлых металлов).n В некоторых случаях возможна РЕНАТУРАЦИЯ, когда денатурирующий фактор действовал кратковременно и нанёс лёгкое разрушение молекуле. В последние годы установлено, что в организме есть белки предотвращающие денатурацию. ШАПЕРОНЫ - класс белков, защищающий в условиях клетки другие белки от денатурации. Они облегчают формирование пространственной конфигурации белков. К ним относятся белки теплового шока или белки стресса.

Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название "шапероны".

1. Классификации шаперонов (Ш)

В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп:

• высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кД;
• Ш-90 - с молекулярной массой от 83 до 90 кД;
• Ш-70 - с молекулярной массой от 66 до 78 кД;
• Ш-60;
• Ш-40;
• низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кД.

Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относят к "белкам теплового шока", быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название "белки теплового шока" возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры.

2. Роль шаперонов в фолдинге белков

При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70.

Ш-70 - высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, ЭР, митохондриях. В области карбоксильного конца единственной полипептидной цепи шаперонов есть участок, образованный радикалами аминокислот в форме бороздки. Он способен взаимодействовать с участками белковых молекул и развёрнутых полипептидных цепей длиной в 7-9 аминокислот, обогащённых гидрофобными радикалами. В синтезирующейся полипептидной цепи такие участки встречают примерно через каждые 16 аминокислот.

Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомернoго комплекса, состоящего из 14 субъединиц (рис. 1-23).

Ш-60 образуют 2 кольца, каждое из которых состоит из 7 субъединиц, соединённых друг с другом. Субъединица Ш-60 состоит из 3 доменов: апикального (верхушечного), промежуточного и экваториального. Верхушечный домен имеет ряд гидрофобных остатков, обращённых в полость кольца, сформированного субъединицами. Экваториальный домен имеет участок связывания с АТФ и обладает АТФ-азной активностью, т.е. способен гидролизовать АТФ до АДФ и Н₃РО₄.

Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит перебор возможных конформации белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.

Рис. 1-23. Структура шаперонового комплекса, состоящего из 14 белковых молекул Ш-60.

Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большого количества энергии.

Таким образом, синтез и фолдинг белков протекают при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры (рис. 1-24).

3. Роль шаперонов в защите белков клеток
от денатурирующих стрессовых воздействий

Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (от англ, heat shock protein).

При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение моляр-ности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать натив-ную конформацию белков.

Рис. 1-24. Участие шаперонов в фолдинге белков. А - участие шаперонов-70 в предотвращении гидрофобных взаимодействий между участками синтезирующегося полипептида; Б - формирование нативной конформации белка в шапероновом комплексе.

Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии, вызванной стенокардией или закупоркой сосудов сердца тромбом. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают поиски фармакологических и молекуляр-но-биологических способов активации синтеза БТШ в клетках.

4. Болезни, связанные с нарушением
фолдинга белков

Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформаций.

Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат. amylum - крахмал). Так же как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом. Это может происходить:

• при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концентрация в клетке;
• при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конформацию других молекул белка;
• при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;
• в результате точечных мутаций в структуре белка.

В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция клеток, наблюдают их дегенеративные изменения и разрастание соединительнотканных или глиальных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидрзами. Для каждого вида амилоидоза характерен определённый тип амилоида. В настоящее время описано более 15 таких болезней.

Болезнь Альцхаймера

Болезнь Альцхаймера - наиболее часто отмечаемый бета-амилоидоз нервной системы, как правило, поражающий лиц преклонного возраста и характеризующийся прогрессирующим расстройством памяти и полной деградацией личности. В ткани мозга откладывается бета-амилоид - белок, образующий нерастворимые фибриллы, нарушающие структуру и функции нервных клеток. бета-амилоид - продукт изменения конформаций нормального белка организма человека. Он образуется из более крупного предшественника частичным протеолизом и синтезируется во многих тканях. Бета-Амилоид, в отличие от своего нормального предшественника, содержащего много спиральных участков, имеет вторичную складчатую структуру, агрегирует с образованием нерастворимых фибрилл, устойчив к действию протеолитических ферментов.

Причины нарушения фолдинга нативных белков в ткани мозга ещё предстоит выяснить. Возможно, с возрастом уменьшается синтез шаперонов, способных участвовать в формировании и поддержании нативной конформаций белков, или увеличивается активность протеаз, что приводит к увеличению концентрации белков, склонных изменять конформацию.

Дата добавления: 2015-10-20 | Просмотры: 752 | Нарушение авторских прав