АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Разбавление спермы

Требования: разбавитель должен создавать с плазмой спермы благоприятную среду. При составлении рецептов разбавителей учитывают, что сперматозоиды сохраняют жизнеспособность при опредлеенной кислотности. Разбавители не должны содержать солей многовалентных металлов, не должно быть ядовитых веществ.

Для приготовления среды берут чистые реактивы, вводят сахара, глюкозу, фруктозу, лактозу, которые служат материалом для гликолиза. Сахара заменяют медом. Разбавитель должен устранять или ослаблять температурный шок, для этого в его состав вводят желток куриного яйца. По мере хранения накапливается молочная кислота. Желток имеет реакцию более кислую, чем сперма рН=6,2. Для нейтрализации вводят цитрат натрия, являющийся буфером, имеющий щелочную реакцию. Для предупреждения развития микроорганизмов в разбавитель добавляют сульфаниламидные препараты и антибиотики. Препарат спермасан-3. На современном этапе менее эффективен данный препарат, потому что используются устаревшие антибиотики. Различают три класса синтетических сред в зависимости от их состава и назначения:

Класс А - Экстендоры. От латинского увеличивать расширять. Это сахарно-солевые растворы, применяемые для разбавления спермы с целью увеличения ее объема, но без охлаждения, хранения и транспортировки. Например, глюкозофосфатные растворы

Класс Б - Протекторы. Защитные среды. Представляют собой те же экстендоры, но с добавлением к ним желтка куриного яйца, глицерина, антибиотиков, которые предохраняют сперматозоиды от холодового удара, кристаллизации при замораживании.

Класс В - Имплементоры. От латинского оснащенные. Те же энстендоры или протекторы, но к ни добавлены специальные вещества, воздействующие на органы размножения самок при осеменении. В эту среду может быть введен фермент муциназа, нейротропные и гормональные (окситоцин). Муциназа разжижает слизь шейки матки и способствует таким образом продвижению сперматозоидов, гормональные и нейротропные увеличивают сокращение шейки матки.

Приготовление разбавителей

Вся посуда и оборудование должны быть чистыми и стерильными. Вода дистиллированная подвергается кипячению. Обязательно замеряют рН воды, должно быть 7. Титрованием доводят до 7.

Разбавитель готовят непосредственно пред получением спермы с тем, чтобы от времени приготовления до момента использования проходило не более 2-3 часов. В стерильную колбу высыпают точно отвешенные в соответствии с рецептом глюкозу и фруктозу, кроме желтка и антимикробных средств, вливают необходимое количество дистиллированной воды и размешивают до полного растворения. Куриные яйца являются дополнительным источником микробного обсеменения. Ярко оранжевый цвет желтка. Чтобы извлечь желток, производятся следующие манипуляции: тщательно моют щеткой скорлупу, протирают сверху спиртовым тампоном, стерильным инструментом раскалывают пополам, сливают белок в банку, желток осторожно перекладывают на стерильный лист фильтровальной бумаги, перекатывают желток по бумаге, чтобы впитались остатки белка. Стерильным ножом делают прокол в пленке желтка и сливают в стерильную мазурку. По Харьковской технологии желток куриного яйца замещен на порошок желтка, термически обработан, стерильный. Спермосан замещен на антибиотики тетрациклинового ряда.

Для приготовления молочного разбавителя берут свежевыдоенное от здоровой коровы или кобылы молоко, процеживают через марлю в стеклянную посуду, подогревают до кипения, снова процеживают, и охлаждают до температуры +30…35⁰С. Затем в молоко добавляют желток, антибиотики и сульфаниламиды. При этом оценивается состояние молочной железы на мастит.

В лаборатории, где проводят разбавление, должна соблюдаться стерильность, температура воздуха должна быть +20…25⁰С.

Режимы хранения спермы – положительные и минусовые температуры

+5…+20 в специальных средах, вызывая явление анабиоза. Это кислотная инактивация. Наиболее легко сперматозоиды переходят восстание анабиоза при воздействии двуокиси углерода, растворенного в плазме спермы, при этом часть СО2 соединяется с молекулами воды, превращается в угольную кислоту н2со3, которая легко проникает через оболочку сперматозоида и тормозит процессы дыхания и глюколиза. В настоящее время изменяют кислотную инактивацию путем добавления в разбавитель двукарбоната натрия, лимонной кислоты, сульфата калия натрия или магния. В результате всё равно образуется угольная кислота. Срок хранения сперматозоидов при этих температурах не более 3 суток.

Режим хранения при температуре 0...+4: применяется глюкозо-желточный разбавитель при искусственном осеменении овец и лошадей. При данных температурах важно удержать в зависимости от рецепта среды те параметры температуры, которые указаны. С каждыми сутками хранения увеличивают объем спермадозы.

Во время хранения обменные процессы в сперме при кислотном анабиозе, а также при температуре 0⁰С значительно снижены, но всё же протекают на довольно заметном уровне. Эти клетки стареют, расходуют питательные вещества, отправляются продуктами обмена, разрушаются и гибнут. Хранение ограничивается несколькими сутками.

Полный анабиоз с почти полным прекращением обменных процессов достигается замораживанием спермы при температурах -79... -198⁰С.

Сперматозоиды чувствительны к низким температурам и погибают при замораживании, основной причиной чего является механическое разрушение кристаллами льда, образующиеся в плазме спермы и сперматозоидов, кристаллы наносят необратимые нарушения в структуре сперматозоидов.

В 40-50х годах прошлого века встала острая проблема длительного хранения спермопродукции. При хранении спермы при плюсовых температурах и близких к нулю хранение ограничено тремя сутками.

В 1946-5-х гг. прошлого века первое глубокое замораживание спермы провел советский ученый Смирнов. Он замораживал сперму в жидком кислороде и твердой двуокиси углерода («сухой лед»). Он получил крольчат, а затем ягнят и телят от самок, осемененных оттаянной спермой.

В дальнейшем над методами замораживания спермы быков работали многие советские и зарубежные ученые: Колдж, Роутсон, Паркс, Милованов.

Для разбавления спермы перед замораживанием применяли среды, содержащие глицерин. В сперме при замораживании в присутствии глицерина кристаллы льда образуют формы листьев папоротника и образуют каналы, в которых сохраняются сперматозоиды. Одновременно глицерин замедляет рост кристаллов.

Состояние половой сферы производителя можно оценить по мазку спермы. В норме половая система функционирует, то в мазке обнаруживают «листья папоротника» или рисунок веток хвои. Если гомогенная масса – имеются нарушения функционирования половой сферы.

Техника замораживания спермы быков сводилась к следующему: сперму разбавляли 1:1 желточно-цитратным разбавителем, охлаждали до +5С, через 3-4 ч ее вторично разводили разбавителями, содержащими 20% глицерина от общего объема. Затем ее выдерживали несколько часов до +5С для адаптации сперматозоидов к синтетической среде. После этого запаянные стеклянные ампулы со спермой замораживали в спирте, охлажденном сухим людом до – 79С.

В настоящее время способ медленного замораживания спермы заменили более производительным методом быстрого или мгновенного замораживания, при котором глубокое охлаждение спермы в форме гранул до температуры -196С (жидкий азот) достигается в течение нескольких минут. В результате удается лучше сохранять структуру сперматозоидов, получать относительно высокую активность сперматозоидов после оттаивания. Перед замораживаем сперму разбавляют 1:1 или 1:10. Среда – дистиллированная вода 100 мл, лактоза 11,5 г, желток 20 мл, глицерин 5 мл. после этого сперму охлаждают при температуре +5…+2 С в течение 4-6 ч и расфасовывают по о,1 или 1 мл на охлажденную фторопластную пластину, в которой сделаны лунки под 0,1 или 1 мл. более совершенная технология – фторопластовый штамп, с помощью которого делаются лунки на прямоугольных кусках сухого льда. Преимущество – поработали и сбросили в мойку, растаяло, мыть не надо. Для следующей партии новый пласт сухого льда.

Пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота (в парах температура –100⁰С) в течение 6 минут. Затем на несколько секунд погружают в жидкий азот (–196⁰С). После этого гранулы собирают, помещают в чашки или контейнеры, или марлевые мешочки, и переносят на хранение в сосуды Дюара с жидким азотом.

Можно замораживать сперму быка в ампулах или капиллярах (пайеты) в токе холодного газообразного азота. В этом случае пакеты с ампулами или капиллярами после охлаждения до +5…+2С опускают на подставки в сосуд Дюара с жидким азотом до соприкосновения с его поверхностью на 3 минуты, где происходит замораживание спермы в жидком азоте до температуры –100С. Затем переносят в секции хранения над жидким азотом (в пары).

По харьковской технологии имеются калибровочные машины. После фасовки (когда в коротких пайетах внутри раствор спермы), закладывают эти калибровочные гранулы в машину, они в барабанах вращаются, и вращаются одновременно вокруг своей оси. Там при температуре -100С идет равномерное замораживание.

Преимущество имеет соломинка. Довольно тонкий капилляр, поэтому даже в парах азота идет равномерное охлаждение и замораживание. Под эти соломинки идут специально сконструированные сосуды Дюара.

После замораживания оттаивают несколько ампул, пайеток или гранул, проверяют активность спермы. Для дальнейшего хранения допускают сперму, имеющую активность не ниже 4 баллов. По мере хранения ежегодно из каждой партии берут 1% от количества доз, оттаивают и оценивают подвижность. Если при хранении подвижность начала снижаться, то партия снижается с хранения.

Учитывая то, что постоянно получают сперму, есть возможность выбраковки спермы и заполнения хранилища свежими образцами.

Необходимо соблюдать технику безопасности при работе с жидким азотом. Сосуд Дюара может быть разной вместимости (несколько сотен литров – в племпредприятиях, до 60 л – в пунктах искусственного осеменения, до 7 л – для транспортировки). Руки должны быть защищены резиновыми перчатками, лицо – защитными очками или маской. Все манипуляции с извлечением и установкой обратно стаканов со спермапродукцией должны проводиться плавно и без резких движений.

Необходимо вести журнал дозаправок азота. Чаще всего прямо на сосуде пишут дату заправки и дату следующей дозаправки. Признаком того, что заканчивается азот, является появление инея на горловине, в дальнейшем возможно объединение. Категорически запрещен доступ к азоту детей. Сосуды красят в яркий красный цвет. При транспортировке не должно быть резких движений сосудов Дюара. Запрещено наличие пассажиров. Ежегодно должна проводиться санация и обеззараживание сосуда Дюара.

Рецепт среды ЛГЦЖ, применяется в современных условиях. Компоненты: лактоза 1,5 г, полиген 0,03-0,06 г, глицерин 5 мл, желток куриных яиц 20 мл, натрий лимоннокислый 0,2 г, води дистиллированная до 100 мл.

Препараты для санации спермы с/х животных:

Полиген – комплексное лекарственное средство для санации спермы и эмбрионов с/х животных, содержащее в качестве действующих веществ антибиотики (гентамицин сульфат и полимексиндесульфат) – оказывают бактерицидное действие на большинство грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, что обеспечивается санитарно-ветеринарное качество спермы производителя.

Спермицин – предназначен для санации спермы с/х животных, содержит в качестве действующих веществ энрофлоксацин и линкомицин. Механизм действия энрофлоксацина основан на способности ингибировать активность фермента геразы, который обеспечивает репликацию ДНК в бактериальной клетке. Относится к группе фторхинолонов. Препарат активен в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Линкомицин подавляет сиснтез микробного белка, более активен в отношении грамположительных микробов, относится к группе линкозамиднх антибиотиков.

Дата добавления: 2015-12-15 | Просмотры: 2457 | Нарушение авторских прав