АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Использование неорганического фосфата в процессе брожения

Процессы диссимиляции углеводов в растительных организмах, микроорганизмах, а также в организмах животных и человека как в анаэробных, так и в аэробных условиях протекают с участием неорганического фосфата.

Молекула фосфорной кислоты включается на стадии окисления 3 –фосфоглицеринового альдегида в 1,3–дифосфоглицериновую кислоту при участии НАД⁺ зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.

3- фосфоглицериновый 1,3 - дифосфоглицериновая

альдегид кислота

1,3–дифосфоглицериновая кислота представляет собой высокоэнергетическое соединение (макроэргическая связь условно обозначена значком ~ “тильда”). Далее происходит передача богатого энергией фосфатного остатка на АДФ с образованием АТФ и 3 - фосфоглицериновой кислоты:

1,3 - дифосфоглицериновая 3 - фосфоглицериновая

кислота кислота

АТФ участвует в фосфорилировании углеводов - в образовании метаболически активных форм сахаров - их фосфорных эфиров, например, из глюкозы путем фосфорилирования образуется глюкозо–6–фосфат под действием фермента гексокиназы:

Мg²⁺

АТФ + L-D-глюкоза ¾¾¾¾¾> АДФ + L-D-глюкоза- 6 - фосфат

гексокиназа

Глюкозо–6–фосфат превращается во фруктозо–6–фосфат под действием фермента фосфоглюкоизомеразы. Далее фруктозо–6–фосфат фосфорилируется при участии еще одной молекулы АТФ и фермента фосфофруктокиназы во фруктозо–1,6–дифосфат.

Принцип метода. Если в начале брожения и в процессе взять одинаковые пробы и проделать качественную реакцию (молибденовую) на фосфорную кислоту, то окажется,что интенсивность образующейся синей окраски в пробах убывает от первой к последней. Это обусловлено тем, что неорганический фосфат постепенно поглощается и количество его в среде уменьшается.

Количество же связанного фосфата в органической форме (АТФ, глюкозо–6–фосфат, фруктозо–6–фосфат и др.) увеличивается. Если пробы подвергнуть гидролизу, то органические соединения фосфора разрушаются и количество неорганического фосфата во всех пробирках будет равно начальной величине – окраска в пробирках будет одинаковой.

Химизм молибденовой реакции на фосфорную кислоту заключается в образовании комплексного соединения 12 молибдофосфата аммония (осадок желтого цвета), которое при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смесь окислов молибдена).

Молибденовая реакция на фосфорную кислоту:

РО₄^–3+ 3 NH₄⁺+ 12 МоО₄^–2 + 24 Н⁺¾® (NH₄)₃РО₄ ^. 12 МоО₃ + 12 Н₂О

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В ступке растирают 1 г отмытых и отделенных на воронке Бюхнера дрожжей с 1 г глюкозы или сахарозы и 5 мл дистиллированной воды. К смеси добавляют 5 мл раствора фосфорнокислых солей, перемешивают и 1 мл смеси переносят в первую пробирку с ТХУ. При этом осаждаются белки, инактивируются ферменты и прекращается брожение.

Оставшуюся смесь переносят в высокий стаканчик и помещают в термостат при 37 °С на 1,5 часа. Через каждые 0,5 часа от начала брожения отбирают из стаканчика по 1 мл бродящей смеси в три пробирки с ТХУ. Через 5 минут после взятия последней пробы содержимое пробирок фильтруют через складчатые фильтры в 4 пронумерованные колбочки и получают безбелковые фильтраты.

В четыре чистые пробирки отбирают по 0,5 мл безбелкового фильтрата из колбочек и проводят молибденовую реакцию на фосфорную кислоту. Для этого в каждую пробирку вносят по 0,1 мл 2,5 % – ного раствора молибденовокислого аммония в серной кислоте и 0,5 мл 0,5 %–ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды, перемешивают и сравнивают окраску жидкости во всех пробирках. Интенсивность окраски должна уменьшаться от первой к четвертой пробирке, так как неорганический фосфат в процессе брожения убывает.

Для гидролиза образовавшихся органических соединений фосфора в четыре пронумерованные пробирки (второй ряд) вносят из колбочек по 0,5 мл безбелкового фильтрата и добавляют по 0,5 мл 2 н. раствора соляной кислоты и ставят в кипящую водяную баню на 8–10 минут. По окончании гидролиза во всех пробирках проделывают молибденовую реакцию.

Результаты работы заносят в таблицу 1, изображая интенсивность окраски знаками +1; +2; +3; +4.

Таблица 1 – Интенсивность окраски молибденовой реакции

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 817 | Нарушение авторских прав