АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение специфичности лактатдегидрогеназы

Прочитайте:
  1. I. Определение верхушечного толчка.
  2. I.1. Определение понятия
  3. II) Энзимологическое определение количества метаболитов.
  4. IV.1. Дыхательная недостаточность. Определение понятия
  5. А) Определение силы неизвестного анатоксина по известной антитоксической сыворотке
  6. А. Определение стресса
  7. А.Определение зон задержки роста микробов
  8. Абсцесс и гангрена легкого. Определение понятий. Классификация.
  9. Абсцесс, флегмона: определение, клиника, диагностика, лечение
  10. Анемия. Определение понятия. Классификация.

 

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:

  О       О      
  //       //      
  С¾ОН   + ЛДГ С¾ОН   +  
  ½ + НАДН + Н ¾¾¾¾> ½ +   НАД  
  С = О       Н¾С¾ОН      
  ½       ½      
  СН3       СН3      

пируват лактат

 

Принцип метода. В ходе реакции кофермент НАДН + Н+ окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н+, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,22×10–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или a–кетоглутарат.

Ход работы. В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н+ и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.

Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД+ рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.

Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.

Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.

Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10–3 М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.

 

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 450 | Нарушение авторских прав


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 |

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)