 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Определение аллерген-специфических IgE in vitro методами радиоаллергосорбентного и хемилюминисцентного анализа
Определение аллерген-специфических IgE с помощью хемилюминисцентного анализа основано на модификации PACT. Проводится реакция сыворотки пациента с панелью аллергенов или смесей аллергенов. Панель содержит отдельные участки целлюлозных нитей с ковалентно связанными аллергенами. Исследование начинается заполнением панели сывороткой пациента. В ходе инкубации IgE сыворотки связываются с покрытыми аллергеном целлюлозными нитями. Затем панель промывают буфером, чтобы удалить несвязавшиеся компоненты сыворотки. В камеру добавляют меченые ферментом анти-IgE, которые связываются с IgE сыворотки, фиксированными на нитях. После второй промывки панель заполняют смесью фотореагентов; в их реакции с мечеными антителами испускается хемилюминисценция. Количество испускаемого света от каждой нити прямо пропорционально количеству аллерген-специфического IgE в сыворотке пациента. Для измерения интенсивности хемилюминисценции используются люминометры или денситометры. Наряду с выявлением специфических IgE используются и другие лабораторные тесты для диагностики как антителозависимых реакций, так и реакции замедленного типа. Данные методы позволяют изучить особенности патогенеза аллергических реакций. К ним относятся - реакции дегрануляции тучных клеток или базофилов, - реакция торможения миграции лейкоцитов крови (РТМЛ), - реакция повреждения нейтрофилов (ППН), - определение свободного связанного гистамина - определение ИЛ 4,5,6, TGFb - определение триптазы и хемоттриптазы
| |||||||||||||
| Протокол лабораторной работы | ||||||||||||||
| Задания | Выполнение | |||||||||||||
| 1. Зарисуйте схему стадий развития аллергической реакции. | ||||||||||||||
| 2. Зарисуйте схему фаз стадии разрешения аллергии. | ||||||||||||||
| 3. Осуществите постановку иммуно-ферментного анализа для определения общего IgE. Постройте калибровочную кривую для определения IgE в исследуемых пробах исходя из известной концентрации и оптической плотности стандартов исследования | ||||||||||||||
| 4. Рассчитайте концентрацию IgE в исследуемых пробах. | ||||||||||||||
| Лабораторная работа 7. Методы диагностики аутоиммунных заболеваний | ||||||||||||||
| Вопросы к занятию | 1. Механизмы формирования II, III, IV, V типов иммунопатологическиого повреждения тканей 2. Системная красная волчанка: иммунопатогенез, диагностика 3. Ревматоидный артрит: механизм формирования синовита, диагностика | |||||||||||||
| Литература |
| |||||||||||||
Методический материал
При диагностике аутоиммунных заболеваний используются следующие группы тестов:
· Тесты, позволяющие обнаружить эффекторные механизмы и факторы, специфичные для АИЗ. Они обладают простотой в постановке (рутинностью) и высокой степенью ассоциации с поражениями тканей. К числу рутинных относятся определение концентрации С-реактивного белка, ревматоидного и антинуклеарного факторов и С3-компонента комплемента. Эти маркеры аутоиммунного процесса позволяют с достаточной точностью поставить диагноз и оценить активность патологического процесса.
· Тесты, предназначенные для определения структурно-функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток. Они имеют вспомогательное для постановки диагноза значение, но важны для контроля эффективности терапии, а также для уточнения патогенеза заболевания.
Помимо специальных иммунологических тестов обязательно исследование общего анализа крови, мочи, белков острой фазы и других биохимических показателей с учетом клиники (тяжесть, острота, осложнения), проводимых в динамике заболевания и терапии.
Определение LE-клеток
На определении LE-клеток (Lupus Erythematosus cells - клетки красной волчанки) основан первый лабораторный метод диагностики системной красной волчанки, разработанный в 1948 г., и широко используемый в нашей стране до сих пор.
LE-феномен имеет три морфологических признака: тельце, розетка, LE-клетка (см. рис1.). LE-феномен является следствием как реакции антител, так и фагоцитоза опсонированного материала клеточных ядер.
Тельце образуется следующим образом. Известно, что LE сывороточный фактор представляет собой антиядерное аутоАт. В результате его соединения с составными частями ядер клетки последние погибают, ядра оголяются. Эти измененные, освобожденные от протоплазмы ядра лейкоцитов и представляют собой LE тельце. Под действием хемотаксиса около LE-тельца скапливаются активные сегментоядерные лейкоциты, образуя форму розетки.
Рис.1 Морфология LE-феномена
LE-клетки представляют собой зрелые нейтрофилы или моноциты с крупными гомогенными базофильными включениями в виде гомогенных аморфных глыбок, состоящих из деполимеризированных ДНК. Вследствие включения крупного свободного ядра других распавшихся клеток ядро фагоцита смещено к краю за счет включения. Таким образом, LE-клетка является конечной морфологической фазой LE-феномена.
In vivo LE-клетки присутствуют в периферической крови, перикардиальном и плевральном выпотах, а также в области поражения кожи. Тестом на выявление LE-клетокопределяют антитела к нуклеопротеидам в 75 (70-95)% случаев. Однако, выявление LE-клеток - трудоемкий и недостаточно чувствительный метод лабораторной диагностики системной красной волчанки, поэтому сейчас для диагностики этого и других аутоиммунных заболеваний используются более простые, легко воспроизводимые методы, основанные на определении антинуклеарных антител (иммунофлуоресцентным или иммуноферментным методами).
Условия проведения реакции
1. Гепаринизированная кровь больного ротируется со стеклянными бусами в шприце (отношение крови и бус = 1:1) и инкубируется в термостате при 370С в течение 10 минут. Затем кровь переносят в центрифужную пробирку.
2. Исследуемая проба крови центрифугируется при 3000 об/мин в течение 3-х минут.
3. Из полученной нейтрофильной пленки приготавливается мазок, фиксируется и окрашивается по Романовскому-Гимзе.
4. Приготовленный мазок микроскопируется под иммерсией.
Определение ревматоидного фактора (РФ)
Диагностическое значение ревматоидного фактора состоит в том, что в высоких титрах они выявляются преимущественно у больных ревматоидным артритом (РА). Наличие РФ подтверждает клинический диагноз. Это легло в основу современного подразделения РА на серопозитивный (при наличии РФ) и серонегативный (при его отсутствии). РФ определяется у 70—80 % больных РА. Имеет прогностическое значение, поскольку свидетельствует о неблагоприятном течении болезни, быстром развитии эрозивно-деструктивного процесса, угрозе возникновения системных проявлений при РА.
Ревматоидный фактор - это аутоантитела к Fc-фрагменту IgG. В сыворотке ревматоидный фактор обычно присутствует в виде комплекса с IgG.
Определение ревматоидного фактора играет важную роль в диагностике ревматоидного артрита, при котором наблюдаются значительные нарушения иммунной системы. Они обусловлены неполноценным иммунным ответом с образованиемем иммунных комплексов. В формировании последних основную роль играет РФ.
Активность РФ может быть реализована через следующие патогенетические механизмы:
1. Превращение растворимых иммунных комплексов в нерастворимые, которые не могут быть фагоцитированы.
2. Стимуляция клеточно-опосредованных реакций.
3. Превращение иммунных комплексов, не связывающих комплемент, в комплементсвязывающие
В низком титре (до 1:80) ревматоидный фактор выявляется у 5% здоровых лиц моложе 60 лет и у 30% — старше 80 лет. Более чем у 75% больных ревматоидным артритом титр ревматоидного фактора в реакции латекс-агглютинации превышает 1:80. В высоком титре ревматоидный фактор выявляется у больных с тяжелым прогрессирующим ревматоидным артритом. При этом обычно наблюдаются внесуставные проявления заболевания, например ревматоидные узелки, системный васкулит, синдром Шегрена. При синдроме Шегрена ревматоидный фактор определяется в наиболее высоком титре. Ревматоидный фактор в сыворотке обычно появляется через 3—6 мес после начала ревматоидного артрита. У серопозитивных больных (больные, в сыворотке которых выявляется ревматоидный фактор) во время ремиссии титр ревматоидного фактора значительно снижается, хотя обычно не нормализуется. Ревматоидный фактор не специфичен для ревматоидного артрита и выявляется при других аутоиммунных заболеваниях, сопровождающихся поражением суставов, инфекционном эндокардите, некоторых хронических заболеваниях печени и идиопатическом фиброзирующем альвеолите
Любые частицы, покрытые IgG, могут быть агглютинированы ревматоидным фактором. Первоначально для обнаружения ревматоидного фактора использовались покрытые антителами эритроциты барана или человеческие эритроциты группы 0 (Реакция Валера-Роза). В последующем их заменили на частицы латекса и бентонита, что повысило чувствительность метода.
Реакция Ваалера-Роза. Используются эритроциты барана, нагруженные антителами кроличьей сыворотки. В присутствии РФ происходит склеивание (агглютинация эритроцитов) в результате взаимодействия его с гаммаглобулином, находящимся на поверхности эритроцитов барана. Реакция считается положительной при титре Ат, превышающем 1:16.
Условия проведения реакции:
Хорошо обезжиренное предметное стекло делят на две равные части. На одну половину стекла помещают каплю разведенной (1:20) исследуемой сыворотки, на другую - такую же каплю 0,9% раствора хлорида натрия (отрицательный контроль). К ним добавляют по капле разведенного диагностикума. Тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стекла на столе. Учет результатов через 3-5 минут с помощью лупы или микроскопа.
Регистрация результатов.
В контрольной пробе и при отриц. реакции - равномерное помутнение.
При положительной реакции в пробе с испытуемой сывороткой эритроциты склеиваются, В капле появляется зернистость. Агглютинация оценивается по следующей условной шкале:
+++ - эритроциты склеиваются в плотные, довольно крупные зерна;
++ - отчетливо выражена мелкая зернистость;
+ - на фоне мутной взвеси эритроцитов слабо выраженная зернистость
Латекс-тест. Исследование латекс-теста позволяет сделать полуколичественное определение РФ в неразбавленной сыворотке методом агглютинации латексных частиц. Метод удобен в использовании, экономически выгоден, время анализа - 2-3 мин. В наборе имеются положительный и отрицательный контроли.
Принцип метода. Основан на реакции агглютинации между РФ образца пациента или контрольной сывороткой и человеческим IgG, находящимся на полистироловых латексных частицах.
IgG, осажденный на латексных частицах + АТ к IgG, находящиеся в исследуемой сыворотке или положительном контроле ® агглютинация латекс-частиц, видная невооруженным глазом
Условия проведения реакции:
1. перед постановкой реакции сыворотку пациента и набор выдержать в течение 30 мин. при комнатной температуре.
2. Пипетировать на слайд-стекло в отдельные лунки:
- сыворотку пациентов - 20 мкл;
- положительный контроль - 20 мкл;
- отрицательный контроль - 20 мкл;
3. добавить в каждую лунку по 20 мкл латексного реагента;
4. осторожно перемешать содержимое лунок стеклянной палочкой; результаты учесть через 2-3 мин.
Регистрация результатов :
· анализ образцов пациентов проводить после получения результатов отрицательного и положительного контролей;
· отсутствие агглютинации в сыворотке указывает на отсутствие РФ; отрицательным будет результат, содержащий в образце РФ менее 20 МЕ/мл;
· положительный: результат (четкая агглютинация) указывает на количественное содержание РФ в сыворотке пациента. При положительной реакции (четкая агглютинация) тест повторить, удваивая разведение сыворотки (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 и т.д.). Наибольшее разведение, при котором происходит агглютинация, считается титром реакции. В сыворотке диагностическим титром в реакции латекс – агглютинации считается 1:20.
· Произвести пересчет содержания РФ в МЕ/мл. Приблизительные значения РФ в международных единицах на мл соответствуют наивысшему разведению с положительным результатом, умноженным на 10. Например:
разведение измерение
1/2 +
1/4 + РФ= 4 х 10 =40 МЕ/мл
1/8 –
Концентрация РФ равная 20 МЕ/мл в плазме – диагностическое значение и свидетельствует о ревматоидном процессе.
| ||||||||||||||
| Протокол лабораторной работы | ||||||||||||||
| Задания | Выполнение | |||||||||||||
| 1. Поставьте тест для определения LE-клеток в исследуемой крови. Микроскопически определите какой из LE-феноменов имеет место в исследуемой пробе. Результаты зарисуйте. | ||||||||||||||
| 2. Определите наличие РФ в исследуемых сыворотках с помощью теста латекс-агглютинации. Результаты зарисуйте. Сделайте вывод, какая форма РА имеется у данного пациента | ||||||||||||||
| 3. В случае положительно резакци, раститруйте сыворотки для полуколичественного определения концентрации РФ. Рассчитайте уровень РФ (МЕ/мл) в исследуемых пробах. Сделайте вывод | ||||||||||||||
| Лабораторная работа 8. Методы диагностики иммунодефицитов | ||||||||||||||
| Вопросы к занятию | 1. Классификация, механизмы формирования первичных и вторичных иммунодефицитов 2. Принципы диагностики иммунодефицитов | |||||||||||||
| Литература |
| |||||||||||||
Методический материал
Иммунодефицитные состояния формируются либо в случае генетических дефектов иммунной системы (первичные иммунодефициты, классификацию см. в табл. 1), либо в результате дисфункции иммунной системы различного уровня и степени выраженности в результате мощного антигенного воздействия (стресс, шок, вирусные и бактериальные инфекции и др., вторичные иммунодефецитные состояния (ИДС)). Уровень иммунокомпетентности организма определяет форму патологии, тяжесть и длительность процесса.
Таблица 1.
Классификация первичных иммунодефицитов (ПИД)
I. Недостаточность гуморального звена иммунитета (системы В-лимфоцитов):
1. Агаммаглобулинемия, сцепленная с полом (б-нь Брутона)
2. Дисгаммаглобулинемии:
а. селективный дефицит IgA
б. дефицит нммуноглобулинов с повышенным уровнем IgM (гипер-IgM-синдром)
в. дефицит субклассов IgG в сочетании или без недостаточности IgA
г. общая вариабельная иммунологическая недостаточность (ОВИН)
II. Недостаточность клеточных иммунных реакций (системы Т-лимфцитов):
1. Гипоплазия вилочковой и паращитовидной желез (синдром Ди-Джорджа)
2. Лимфоцитарная дисгенезия (с-м Незелофа, французский тип ИДС)
III. Комбинированные ИДС (тяжелая комбинированная иммунологическая недостаточность – ТКИН):
1. Ретикулярная дисгенезия
2. Наследственный алимфоцитоз (швейцарский тип ИДС)
3. Дефицит молекул МНС-II класса (синдром "голых" лимфоцитов)
4. Синдром Вискотта-Олдрича
5. Атаксия-телеангиэктазия (с-м Луи-Бар)
IV. Недостаточноть фагоцитоза:
1. Нарушение хемотаксиса, миграции н дегрануляции:
а. синдром Чедиака-Хигаси
б. гипер IgE синдром
в. дефицит GP 110
г. дефект связывания актина
Результаты иммунологического исследования интерпретируются, учитывая нормативные показатели иммунной системы человека (см. табл. 2) и делается заключение. Таблица 2. Дата добавления: 2015-02-06 | Просмотры: 916 | Нарушение авторских прав |
Радиоаллергосорбентный тест (PACT) используется для определения уровней аллерген-специфических антител различных классов (IgE, IgG4) в сыворотке крови. К испытуемой сыворотке добавляют нерастворимый полимер с фиксированным на его поверхности аллергеном. Происходит связывание аллергена со специфическими антителами (если они имеются). После отмывания неспецифических IgE добавляют антитела против IgE, меченые радиоактивным йодом. Если в сыворотке имеются соответствующие аллергену антитела, то происходит образование комплекса: аллерген на бумаге + специфический IgE + антитела к IgE. Количество связавшихся меченых изотопом aнти-IgE-антител показывает количество специфических IgE в сыворотке (см. Рис.2).