 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Нормативные показатели состояния иммунной системы у человека
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Протокол лабораторной работы | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Задания | Выполнение | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. Решение ситуационных задач по предложенным иммунограммам, учитывая нормативные показатели состояния иммунной системы: a) Опишите обнаруженные отклонения в иммунограмме b) Сделайте вывод | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 9. Методы специфической профилактики инфекционных заболеваний | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Вопросы к занятию | 1. Антигены микроорганизмов, их свойства 2. Механизмы противомикробного иммунитета 3. Способы создания активного и пассивного иммунитета для профилактики развития инфекционного заболевания. 4. Понятие о коллективном иммунитете. 5. Вакцины, их виды, требования к вакцинам 6. Иммунные сыворотки, показания к применению | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Литература | 1. Лекционный материал по курсу иммунология (3 курс), микробиология и вирусология (2 курс) 2. А.А. Ярилин Основы иммунологии, 1999 г., 382 - 407 3. Р.М.Хаитов с соавт., Иммунология, 2000 г., стр. 227 - 256 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Методический материал Для предотвращения распространения инфекционного заболевания в популяции людей, проживающих на конкретной территории, необходимо наличие значительного количества организмов (не менее 75 - 90% от всей популяции), обладающих факторами иммунной защиты к инфекционному агенту, т.е. обладающих иммунитетом. Таким образом, под коллективным иммунитетом подразумевается наличие иммунных лиц в популяции. Коллективный иммунитет формируется в естественных - при контакте с инфекционным агентом, сопровождающемся развитием инфекционного заболевания и иммунитета), и искусственных условиях - иммунитет вырабатывается после вакцинации. Вакцинация позволяет предотвращать развитие эпидемий инфекционных заболеваний на регулярной основе. В то же время поставакцинальный иммунитет отличается меньшей продолжительностью и напряженностью, чем естественный. Это означает необходимость периодического мониторинга коллективного иммунитета в популяции, т.е. определения контингента людей, не имеющих защитных механизмов против конкретного инфекционного агента, а значит - подлежащих вакцинации. Так как при определении коллективного иммунитета обследуются большие массы людей, то метод должен быть простым, доступным и недорогим. Наиболее часто определение коллективного иммунитета проводится с помощью реакций серологического метода. Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. В большинстве случаев материалом является сыворотка крови, содержащая антитела. Для их обнаружения добавляют диагностический препарата антигена, называемый диагностикумом. Связывание антител с антигенами приводит к формированию иммунных комплексов, конгломерат которых модно обнаружить визуально. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами - агглютинацией (объединение комплексов антиген-антитело при поливалентности и корпускулярности антигена, что приводит в последующем к образованию плотного осадка) и преципитацией (укрупнение комплексов Аг-Ат в случае водорастворимости и поливалентности антигена). В то же время, среди микробных антигенов присутствуют и такие, которые индуцируют синтез непреципитирующих антител. Образование комплекса Аг-Ат в данном случае не сопровождается ни феноменом агглютинации, ни феноменом преципитации, а выявление факта образования комплекса Аг-Ат требует маркирования диагностического компонента реакции специальными метками, либо перевода диагностического антигена в другое агрегатное состояние. Одним из таких способов является сорбция микробного антигена на эритроцитах барана или частицах латекса. Такой диагностический препарат называется эритроцитарным диагностикумом или латекс-диагностикумом. В данном случае имеющийся водорастворимый антиген становится водонерастворимым, благодаря его связыванию с эритроцитом. Соответственно, такая серологическая реакция называется реакцией пассивной гемагглютинации (латекс-агглютинации) - РПГА. Количественной характеристикой присутствия антигенспецифических антител является титр антител. Титр антител - это максимальное разведение исследуемого материала, дающее положительный результат серологической реакции. Титр Ат (или Аг) выражается разведением исследуемого материала, например, 1: 16, 1: 250 и т.п. Диагностический титр - это титр антител, характерный для большинства случаев конкретного инфекционного заболевания, определяемый на пике гуморального иммунного ответа. Диагностический титр определяется путем многочисленных исследований, выполняемых на базах различных лабораторий. Для определения титра антител нужно перед постановкой серологической реакции приготовить ряд разведений исследуемого материала. При приготовлении разведений сыворотки крови используют раствор электролита (чаще всего изотонической раствор хлорида натрия). Шаг разведения (титрования) задается соотношением объема раствора электролита и объема сыворотки крови. Например, при последовательных разведениях с шагом в 2 раза в 1-й пробирке смешиваются равные объемы раствора электролита и сыворотки крови, при шаге в 5 раз к 4-м объемным частям раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки, при шаге в 10 раз - к 9 объемам раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки крови. Процесс приготовления разведений сыворотки крови обычно проводится в пробирках или круглодонных планшетах (или стрипах). Приготовление ряда разведений сыворотки крови, или титрование сыворотки крови | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Компоненты | Номера опытных пробирок | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| реакции (в мл) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. Электролит | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. Исслед. .сыв-ка | 0,1 | 0,1 | - | - | - | - | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Манипуляция | перемешать и перенести 0,1 мл ® | перемешать и перенести 0,1 мл ® | перемешать и перенести 0,1 мл ® | перемешать и перенести 0,1 мл ® | перемешать и вылить 0,1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Разведение | цельное (1: 1) | в 2 раза (1:2) | в 4 раза (1:4) | в 8 раз (1:8) | в 16 раз (1:16) | в 32 раза (1:32) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| После титрования исследуемой сыворотки крови в лунки стрипа вносят диагностикум. Затем проводят инкубацию в необходимом режиме и учитывают результат реакции визуально. Для оценки интенсивности серологической реакции используют принцип 4 "+". РПГА, оцениваемая как резко положительная, проявляется ++++, это означает высокое содержание антител, сопровождающееся полным 100% связыванием антигена. Визуально обнаруживается плотный осадок эритроцитов с неровным, фестончатым краем ("зонтик"), при встряхивании осадок сохраняет свое состояние. РПГА, оцениваемая как +++, означает 75% связывание антигена. Визуально осадок эритроцитов также плотный с фестончатым краем, но при встряхивании частично распадается. РПГА, оцениваемая как ++, означает 50% связывание антигена. В этом случае можно обнаружить осадок эритроцитов с фестончатым краем, но часть эритроцитов образует "облачко" в растворе, либо наслаивается на агглютинат. +/- РПГА сопровождается оседанием эритроцитов на дно в виде "пуговки", т.е. осадка с ровными краями. В этом случае антитела отсутствуют, либо их количество мало и склеивания эритроцитов не происходит. Титр антител определяется не менее, чем по ++ реакции. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Протокол лабораторной работы | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Задание | Выполнение | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. Зарисуйте механизм РПГА | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. Поставьте РПГА по предложенной схеме и определите титр антител к вирусу кори | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3. Сделайте выводы о необходимости вакцинации по предложенным вариантам исследования | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 10. Методы изучения противоопухолевого иммунитета | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Вопросы к занятию | 1. Опухоль-ассоциированные антигены 2. Механизмы противоопухолевого иммунитета 3. Механизмы ускользания опухолей от иммунологического надзора | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Литература | 1. Лекционный материал 2. А.А. Ярилин Основы иммунологии, 1999 г., 408 - 420 3. Н.В.Пивень., А.А.Милютин Онкоиммунология, 2001 г., стр. 10 – 54 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Методический материал В диагностике опухолевых заболеваний особое место занимает идентификация и количественный анализ опухолевых маркеров - антигенов, появляющихся на поверхности опухолевых клеток (и/или в циркуляции - в крови) и, как правило, отсутствующих в здоровом организме. Для их детекции в настоящее время применяют методы современного иммунохимического анализа (ИХА), в частности, методы радиоиммунного и иммуноферментного анализа (РИА и ИФА). Принцип методов ИХА основан на обратимой реакции взаимодействия антигена - АГ (лиганда) со специфическим антителом (АТ) - связывающим агентом - с последующим образованием растворимого комплекса «антиген-антитело», которая подчиняется закону действующих масс. Условия реакции подбираются таким образом, что добавляемый в систему меченый АГ (АГ*) конкурирует с немеченым АГ за ограниченное число мест связывания на антителах. Согласно закону действующих масс, количество связанного с АТ меченого АГ находится в обратной зависимости от количества немеченого (анализируемого антигена). После установления равновесия в аналитической системе свободную и связанную фракции разделяют и измеряют активность одной из них. Процесс реакции между компонентами можно выразить уравнением: АГ + АТ Û [АГ-АТ] + АГ* Ýß [АГ*-АТ] Наиболее распространенными средствами ИХА являются методы РИА и ИФА, которые являются родственными и отличаются друг от друга лишь типом используемой метки (радиоизотоп в РИА; фермент в ИФА) и способом детекции результатов реакции (радиоизотопный счетчик для РИА; иммуноферментный анализатор (или спектрофотометр) для ИФА). В клинической практике методы ИХА используют для диагностики и визуализации опухолевого очага у лиц с наличием определенных клинических признаков, для определения локализации опухоли, установления степени распространения злокачественной опухоли, оценки эффективности противоопухолевой терапии и выявления групп риска в отношении различных типов онкопатологии. В настоящее время наиболее используемыми методами в иммунодиагностике опухолей являются следующие модификации методов ИХА: · методы in vitro (РИА и ИФА) для количественного определения концентраций опухолевых антигенов в крови (или других биологических жидкостях - эксудате, моче, желудочном соке и т.д.), принцип которых описан выше; · метод иммуноморфологического анализа на основе МАТ (чаще всего это модификации ИФА) для обнаружения опухолевых антигенов на срезах тканей, полученных из материала биопсий, или на поверхности изолированных опухолевых клеток и т.д.; · методы «in vivo» (иммуносцинтиграфия) на основе МАТ: меченные радиоизотопом МАТ*, введенные в организм, «отыскивают и узнают» свой антиген, образуя с ним достаточно устойчивый иммунокомплекс «антиген-МАТ*». Дальнейшее использование регистрации радиоактивного излучения позволяет локализовать и визуализировать патологический очаг. Определение концентрации раково-эмбрионального антигена (РЭА) с помощью набора для радиоиммунологического определения РЭА в сыворотке крови (рио-РЭА-125I-М) отечественного производства - ХОП ИБОХ НАН Б Назначение набора: Набор рио-РЭА-125I-М предназначен для определения концентрации РЭА в сыворотке крови человека методом РИА. Результаты измерения содержания РЭА могут быть использованы: · в качестве дополнительного критерия при первичной диагностике рака ободочной и прямой кишки, желудка, поджелудочной железы, легкого и определения стадии злокачественного процесса; · для оценки эффективности хирургического, лекарственного, лучевого и комбинированного лечения; · для доклинического выявления рецидива заболевания. Состав набора: · [125I]-РЭА, активность в пределах - 40...65 кБк, лиофилизованный препарат (1 флакон); · 6 калибровочных проб РЭА в сыворотке крови человека, соответствующие следующим концентрациям РЭА: 0 нг/мл (С0), 5 нг/мл (С1), 15 нг/мл (С2), 45 нг/мл (С3), 120 нг/мл (С4), 360 нг/мл (С5), лиофилизованные препараты (6 флаконов); · антисыворотка к РЭА, лиофилизованный препарат (1 флакон); · контрольная сыворотка, лиофилизованный препарат (1 флакон); · преципитирующий реагент С (или Ц), 11 мл суспензии, готовый к использованию (1 флакон); Оборудование, материалы: Сцинтилляционный счетчик для измерения активности изотопа 125I, вихревой смеситель, прибор для встряхивания пробирок, магнитная мешалка, водоструйный насос, полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкостей: 0,1; 0,5; 1,0 мл, пробирки пластмассовые вместимостью 3...5 мл с пробками, штатив для пробирок,пипетка стеклянная вместимостью 10 мл, цена деления - 0,1 мл, стакан химический или колба плоскодонная вместимостью 50 мл., вода дистиллированная. Приготовление реагентов и проведение анализа: 1. Калибровочные пробы. Во флаконы с калибровочными пробами внести по 0,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать, избегая образования пены, до полного растворения. В результате получают растворы со следующими концентрациями РЭА: 0 нг/мл (С0), 5 нг (С1), 15 нг/мл (С2), 45 нг/мл (С3), 120 нг/мл (С4), 360 нг/мл (С5), 2. Контрольная сыворотка. Во флакон с контрольной сывороткой внести 0,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать, избегая образования пены, до полного растворения. 3. Антисыворотка к РЭА. Во флакон с антисывороткой к РЭА внести 11 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать, избегая образования пены, до полного растворения. 4. [125I]-РЭА. Во флакон с [125I]-РЭА внести 11 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать, избегая образования пены, до полного растворения. 5. Преципитирующий реагент С (или Ц) поставляется готовым к употреблению Проведение анализа: · Пробирки для анализа (в дубликатах) маркируют следующим образом: Т - общая активность [125I]-РЭА; С0...С5 - калибровочные пробы РЭА; Ск - контрольная сыворотка; Сх - исследуемые пробы сыворотки крови. · В пробирки С0...С5 внести по 0,1 мл раствора из флаконов с соответствующими калибровочными пробами. В пробирки Ск внести по 0,1 мл раствора из флакона с контрольной сывороткой. В пробирки Сх внести по 0,1 мл исследуемой сыворотки крови. · Во все пробирки, кроме Т, внести по 0,1 мл антисыворотки к РЭА. · Во все пробирки внести по 0,1 мл [125I]-РЭА. · Пробирки закрыть пробками, встряхнуть на вихревом смесителе и инкубировать в течение 20...24 часов при комнатной температуре (18...25°С). · Во все пробирки, кроме Т, внести по 0,1 мл преципитирующего реагента С (или Ц), встряхнуть пробирки на вихревом смесителе и инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре (18...25°С). · Все пробирки, кроме Т, центрифугировать при 1500...2000 g в течение 15 минут. · После центрифугирования удалить из пробирок надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса, избегая захватывания осадка. · Все пробирки поместить в гамма-счетчик и измерить скорость счета 125I в кажой пробирке в течение 1 минуты. Расчеты и графические построения: · найти среднее арифметическое значения скоростей счета 125I для каждой пары пробирок. · Рассчитать значение 100В0/Т, где В0 - среднее арифметическое значение скорости счета 125I в пробирках С0, Т - общая активность [125I]-РЭА, измеряемая средним арифметическим значением скорости счета 125I в пробирках Т. · Рассчитать значение 100В/В0 для каждой калибровочной и исследуемой пробы, где В - среднее арифметическое значение скорости счета 125I в пробирках С1...С5, Ск и Сх. Построить калибровочную кривую в координатах logit-log или полулогарифмических координатах, откладывая по оси ординат (линейная) значения 100В/В0, %, а по оси абсцисс (логарифмическая) - значения концентраций РЭА, нг/мл, в соответствующих калибровочных пробах. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Протокол лабораторной работы | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Задание | Выполнение | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. Зарисуйте принцип РИА и ИФА | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. Поставьте РИА (или ИФА) для детекции онкомаркера с помощью предложенной тест-системы | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3.Провести расчеты и графические построения | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Дата добавления: 2015-02-06 | Просмотры: 607 | Нарушение авторских прав