АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Опишите методику постановки РНГА и видимый рез-т р-ции. С какой целью ее ставят?

19, 20,21 РНГА – основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности растворенные антигены и гаптены бактерии, вирусов, др. микробов и их токсины. При этом эритроциты приобретают серологическую специфичность сорбированных антигенов и вместе с ней способность агглютинироваться сыворотками, содержащими антитела против этих антигенов. Такие диагностикумы используют в РНГА для серодиагностики. Методика постановки: исследуемую сыворотку, предварительно инактивированную при +56 град. С в теч. 30 мин. для уничтожения комплемента, разводят от 1:20 до 1:12000 и разливают в лунки по 0,5 мл, к кажэдому разведению добавляют по 0, 1 мл эритроцитарного диагностикума, реакцию выдерживают в теч. 2 часов при 37 град. С. Рез-ты: + - осадок эритроцитов в лунке имеют форму зонтика, «-» - эритроциты оседают в центре дна лунки в виде пуговки.

Другие диагностикумы: РНГА ставят также с антительными эритроцитарными диагностикумами, а этом случае на эритроцитах сорбированы Ig (т.е. известные антитела), а определяют неизвестные антигены – возбудители бак. или вирусных инфекций, а также токсины. Эта р-ция называется РОНГА.

Существуют различные варианты р-ции непрямой (пассивной) агглютинации, в которых для сорбции антигенов или антител используют не эритроциты, а разл. инертные носители - частицы латокса, целлюлозы и др.

22. Что представляет собой р-ция преципитации? Охар-те ингредиенты и мех-м р-ции, назовите способы постановки, практическое применение.

Р-ция преципитации – это осаждение преципитиногена (мелкодисперсные антигены) специфическими антителами преципитинами в присутствии электролитов. Выпадение растворимого комплекса «антиген+антитело» наблюдается при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Ингредиенты: антитела – испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка, антиген – экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих м/о. Способы постановки – преципитация в жидкой среде (р-ции флоккуляции, р-ции кольцепреципитации) и преципитация в геле.

23. Опишите принципы постановки р-ции кольцепреципитации и ее видимый рез-т. Что понимают под титром р-ции? Пример практического использования.

Р-ция кольцепреципитации: в узкие пробирки наливают одно и тоже разведение сыворотки, а затем осторожно пастеровской пипеткой наслаивают исследуемый преципитиноген, учет через 1-2 мин. Контроль с нормальной сывороткой, на которою наслаивают преципитиноген. При «+» р-ции на границе между сывороткой и преципитиногеном появляется преципитат в виде белого кольца, в контроле он отсутствует. Титр р-ции является то наиб. разведение преципитиногена, в котором еще образуется это кольцо.

24. Опишите принцип постановки р-ции преципитации в геле (по Оухтерлони) и ее видимый рез-т, с какой целью ее применяют?

Преципитация по Оухтерлони: принцип метода состоит в том, что антиген и антитело, реагируя в геле образует преципитат в виде линии белого цвета. В чашке Петри наливают просветвленный агар и в нем делают несколько лунок на равном расстоянии др. от друга (одна в центре, остальные вокруг нее). В центральные антитела, в лунки по периферии испытуемые антигены. + р-ция – образуются линии преципитации между лунками сыворотки и преципитиногеном.

25. Понятие об иммуноэлектрофорезе, принципы постановки, применение.

Иммунноэлектрофорез - это метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлони на одной и той же пластинке агарового геля. Метод: 1 этап – исследуемое в-во разделяют при помощи электрофореза в геле на составные компонент с различной электрофоретической подвижностью; 2 этап – проводят р-ции преципитации в геле. Антитела и разделенные электрофорезом антигенные компоненты диффундируют в геле на встречу друг другу и образуют дуги преципитации различной кривизны и расположения.

26. Сходство и различия р-ции агглютинации и преципитации.

Различия между ними зависит главным образом от величины частиц антигена. Преципитация – это когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, то это агглютинация.

Занятие № 14.

1. Антитела являются уникальными сывороточными белками – глобулинами, которые вырабатываются в ответ на поступление в организм антигена и способны с ним специфически взаимодействовать. Существуют 5 различных классов Ig: Ig G; Ig M; Ig A; Ig E; Ig D, они различаются по молекулярной массе, содержанию углеводов, составу полипептидных цепей, коэф. седиментации и др. хар-кам. Основная структурная ед. молукулы Ig состоит из двух идентичных полипептидных L-цепей (легкие) и двух идентичных H-цепей (тяжелые). Эти четыре цепи ковалентно связаны дисульфидными связями.
2. Ig G – состоит из двух тяжелых цепей и 2 легих цепей. Тяжелая цепь назыв. гамма, а легкая лямбда. IgG - это основной класс сывороточных Ig, составляет примерно 70-80% от всех сывороточных Ig. Коэффициент 7S. Период полураспада 2-3 дня. 4-е подкласса – от Ig 1 до Ig 4. Он легко проникает через плаценту, у детей достигает уровня взрослого человека в сыворотке к 5 годам. Ф-ции: образование комплекса антиген-антитело; усиление фагоцитоза; активация комплемента по классическому пути; участвует в гиперчувствительности немедленного типа (вызывает выброс вазоактивных аминов); участвует в аутоаллергии; нейтрализует вирусы и бактерии.
3. Ig M – состоит из 10 легких и 10 тяжелых цепей. Коэф. седиментации 19S. Период полураспада 5-6 дней. Достигает уровня взрослого человека у детей в сыворотке к 1 году. Ф-ции: образует комплекс антиген-антитело; активирует комплемент по классическому пути; нейтрализует вирусы бактерий.
4. Ig A – составляет от 10 до 15% всех сывороточных Ig. Период полураспада 5-6 дней. Уровень взрослого в сыворотке ребенка к 13 годам. У человека имеется два изотипа этого IgA1 и IgА2, причем в сыворотке преобладает подкласс IgА1, а в секретах несколько больше содержится IgА2. Секреторные Ig класса IgА (SIgA) отличается от сывороточных наличием секреторного компонента, связанного с 2 или 3 мономерами IgА. Св-ва: препятствует связыванию антигена со слизистыми оболочками; осущ-ют транспорт полимерных иммунных комплексов, содержащих IgА; в процессе транспорта через эпителиальные клетки они нейтрализуют находящиеся в ней вирусы.

1. Строение и функции активного центра.

Активные центры антитела образуются доменами вариабельных участков обеих цепей; они образуются только при совместном участии N-концевых половин тяжелой и легкой полипептидных цепей. Специфичность же активного центра определяется первичной структурой той или иной полипептидной цепи, т.е. генетически предопределена. Ф-ции: антитело только тогда свяжет соответствующий антиген, когда его детерминантная группа полностью вместится в щель активного центра, подобно тому как ключ полностью входит в замочную скважину. Т.к. активный центр для каждого возможного антигена предопределен первичной структурой L- и H-цепей это обстоятельство говорит об уникальном механизме генетического контроля биосинтеза антител.

1. Валентность антител – это количество активных центров в молекуле антител. IgG – двухвалентный, IGM – поливалентный; мономерные молекулы IgA хотя и имеют два активных центра не осаждают антигены, т.к. их активные центры настолько сближены, что IgА не может выполнять роль связующего мостика.
2. Авидность – это способность к облазованию прочного соединения между мультивалентным антителом и антигеном.

Афинность – это прочные связи между активным центром антитела и гомологичной антигенной детерминантой.

1. Комплемент – это сложная защитная система белков сыворотки крови, обладающая ферментативной активностью. Состоит из 9 основных компонентов, обозначаемых символом С (С1, С2, С3… С9), большинство компонентов состоит из субкомпонентов. Активация комплемента идет двумя путями: классический путь (наступает в присутствие комплекса антиген+антитело к которому в определенной последовательности присоединяются все компоненты комплемента) и альтернативный путь (неспецифичен, происходит при отсутствии антител – каскад р-ций запускается липополисахаридами клеточной стенки бактерий, некоторыми лек. в-вами и для активации необходимо присутствие ряда белков, в том числе пропердина).
2. Р-ции иммунного лизиса – это растворение жизнеспособных клеток (корпускулярных антигенов), соединенных со специфическими антителами в присутствии комплемента. Это приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Разновидности: р-ция гемолиза и р-ция бактериолиза.
3. Р-ция бактериолиза – это расстворение бактерий в присутствии специфических антител – бактериолизинов и комплемента. Ингредиенты: живые бактерии, специфические по отношению к ним антитела (иммунная сыворотка или иммунизированное животное), комплемент. Применение: как защитная р-ция бактериолиз наиболее выражен при холере, сальмонеллезных инфекциях. Постановка: в пробирку вносят взвесь живых бактерий, специфическую иммунную сыворотку и комплемент, в контрольную пробирку – те же бактерии, сыворотку без антител и комплемент; на 2 часа в термостат при 37 град. С. Затем из каждой пробирки делают высевы по 0,1 мл на чашки Петри с МПА. Учет опыта: на чашке с высевом из опытной пробирки колоний значительно меньше, чем в контроле.
4. Р-ция иммунного гемолиза – это растворение эритроцитов в присутствии специфических антител – гемолизинов и комплемента. Р-ция иммунного гемолиза уч-ет в р-ции связывания комплемента в качестве индикаторной системы. Ингредиенты: эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент. Постановка: берут 5 пробирок – первая из которых является опытом, остальные 4-е контроля, добавляют ингредиенты, в том числе и эритроциты собаки (для контроля специфичности антигена), инкубация при 37 град. С в течении 30 мин. Учет: + - гемолиз (жидкость ярко-розового цвета); «-» - отсутствие гемолиза (жидкость бесцветная, на дне осадок эритроцитов.
5. РСК - основана на способности комплемента абсорбироваться на любом комплексе антиген+антитело. Уч-ет две системы: основная и индикаторная, а также комплемент. 1. (основная система) – состоит из определяемого антитела и известного антигена, к ним добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют др. др., то образуется комплекс антиген+антитело к которому присоединяется комплемент (процесс связывания комплемента невидимый). Чтобы выявить наличие или отсутствие связывания комплемента и тем самым подтвердить соответствие антигена и антитела в первой системе или их несоответствие в РСК уч-ет 2 (индикаторная система) – антиген-антитело: эритроциты барана+гемолитическая сыв-ка. Если есть комплекс антиген+антитело, то при добавлении индикаторной системы гемолиза не произойдет, если же нет соответствия между определяемым и известным антителом гемолиз эритроцитов будет.
6. Ингредиенты РСК – исследуемая сыв-ка, комплемент, известный антиген (корпускулярный или растворимый), эритроциты барана, гемолитическая сыв-ка, физ. р-р. Подготовительная работа перед постановкой основного опыта РСК заключается в титровании, т.к. при постановке РСК необходимо соблюдение точных количественных соотношений между ингредиентами р-ций. Титр комплемента – это содержимое пробирки с наименьшим количеством комплемента, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов в присутствии гемолитической сыв-ки. В основной опыт РСК берут рабочую дозу комплемента (должна превышать его титр на 20-30 %).
7. Схема постановки РСК. Производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыв-ки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 град. С в течении 1 часа. Если в сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном и комплексом антиген+антитело свяжут добавленный комплемент; если же в сыворотке антитела отсутствуют, комплекс антиген+антитело не образуется и комплемент останется свободным. Учет р-ции: + + + + резко положительная р-ция – полная задержка гемолиза (эритроциты оседают на дно пробирки, жидкость над осадком бесцветная); + + + и + + положительная р-ция – неполная задержка гемолиза (имеется осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет, при + + жидкость более розового цвета, чем при + + +); + слабо положительная р-ция (неполный гемолиз: незначительный осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет); «-» отрицательная р-ция - полный гемолиз (жидкость ярко-розового цвета – лаковая кровь, осадок отсутствует).
8. Цель применения РСК – РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и широко используется в серодиагностике инфекционных заболеваний как для определения антител, так и антигенов в исследуемых материалах от больных.

Занятие № 15.

Дата добавления: 2015-05-19 | Просмотры: 942 | Нарушение авторских прав