АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ВВЕДЕНИЕ. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК, содержащий специфическую генетическую информацию любого организма среди огромного количества другой ДНК и многократно размножить искомый фрагмент в случае, если он действительно присутствует в исследуемом материале. При ПЦР-диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только строго специфическая нуклеотидная последовательность, имеющаяся лишь у данного возбудителя.

В начале 70-х годов норвежским ученым К. Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории Нобелевского лауреата Х.-Г. Кораны (Har Gobind Khorana) впервые были описаны основные принципы амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК-синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной, так как ёще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. К. Мюллисом (Kary Mullis). За разработку ПЦР-метода он был удостоен Нобелевской премии в области химии в 1993 г.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в:

l диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию:

l в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных (муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия), онкологических и др. заболеваний;

l HLA–типировании;

l гражданской (определение родства) и судебной медицине (идентификация личности);

l генотипировании микроорганизмов, оценке их вирулентности;

l определении устойчивости микрофлоры к антибиотикам;

l пренатальной диагностике;

l биологическом контроле препаратов крови.

Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология.

Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность.

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПЦР

Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Схема "ДНК—>РНК —> белок" с необратимостью процессов передачи информации, обозначаемых стрелками, получила название "центральной догмы молекулярной биологии".

Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости, она выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а также в высокой рабочей температуре этого фермента (оптимум работы +72 °С).

Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК – одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. Хотя по своему химическому строению РНК несколько отличается от ДНК, она, тем не менее, выполняет у этих вирусов роль, аналогичную роли ДНК (табл. 1).

ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов. Каждый нуклеотид (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ и дУТФ в РНК) содержит гетероциклическое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основание), пятиуглеродное сахарное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Две полинуклеотидные цепи в ДНК соединяются двумя или тремя водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями.

Таблица 1

Основные различия между ДНК и РНК

В основу модели ДНК легли ее свойства:

l комплементарность, когда в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны бок о бок водородными связями за счет образования пар Г–Ц, Ц–Г, А–Т и Т–А;

l антипараллельность комплементарных цепей – две полинуклеотидные цепи идут в противоположных направлениях: 5’-конец одной нити соответствует 3’-концу второй нити.

Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз – происходит раскручивание спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+”) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплементарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК (праймера) с комплементарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-”), только в этом случае наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить синтезируется от материнской молекулы ДНК, а вторая – дочерняя, вновь синтезированная.

МЕХАНИЗМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР

Праймеры

Праймеры – искусственно синтезированные короткие, длиной 20–30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комп­ле­мен­тар­ные 3’-концам цепей искомой ДНК-матрицы. В геноме искомого организма выбирается консервативная (редко подвергающаяся генетическим перестройкам), строго специфическая нуклеотидная последовательность. К ней синтезируются специфические праймеры. Таким образом, фрагмент молекулы, который будет фланкировать (ограничивать) праймер, должен присутствовать только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и отсутствовать в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Правильно подобранные праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации и обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Полимераза

Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов. Для определения РНК-содержащих вирусов используется фермент обратная транскриптаза, который по РНК-матрице синтезирует ДНК-копию, которая затем участвует в ПЦР.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Строительный материал для синтеза комплементарных цепей (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ).

Ионы двухвалентных металлов

Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы.

Буферы

В стандартной ПЦР используются солевые буферы на основе 10–70 мМ “Трис-HCl” при рН 8–9 (20 ^oC). В буфер добавляются активаторы ПЦР – соли хлорида калия или сульфат аммония и стабилизаторы ДНК-полимераза – бычий сывороточный альбумин или желатин, а также неионные детергенты “Triton X100”, “Nonidet NP40” и “Tween 20”.

Анализируемый образец

Образец может быть подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК. Например, ДНК микроорганизмов, служащая мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Циклический температурный режим

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 1).

Рис. 1. Этапы ПЦР-анализа.

1. Денатурация. Расплавление спирали ДНК и расхождение нитей. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96 °C на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг. Присоединение праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают. При понижении температуры одноцепочечная ДНК стремится восстановить двухцепочечное состояние и, если в реакционной смеси есть мишень (искомая ДНК), то праймеры гибридизуются с мишенью. ДНК-праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно увеличен или амплифицирован. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65 °С. Время отжига 20–60 сек.

3. Элонгация. Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом Тaq-полимеразой и проходит при температуре 70–72 °С. Время протекания синтеза 20–40 сек.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одного этапа реакции к другому достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93–95 ^оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединению или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50–65 ^оС. Далее смесь нагревают до 70–72 ^оС – оптимум работы Тaq-ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Многократное, или циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК (ампликона).

СТАДИИ ПОСТАНОВКИ ПЦР

ПЦР-диагностика состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, проведению ПЦР (амплификации) и детекции продукта ПЦР. Для РНК-содержащих вирусов дополнительно проводят реакцию обратной транскрипции (получение кДНК, являющейся комплементарной вирусной РНК-матрице).

Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК)

До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают.

Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз).

Существует два подхода при обработке проб: сложный и простой (табл. 2).

Таблица 2

Основные отличия методов выделения ДНК

Сложный – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т.д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

Простой – используют при работе с «чистыми» пробами, т.е. без гемолиза, слизи, дебриса и т.д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При его использовании формируется определенный процент ложноотрицательных результатов, что объясняется неполной экстракцией ДНК и присутствием ингибиторов реакции в пробе.

Существуют следующие подходы очистки нуклеиновых кислот.

1. Использование детергентов для разрушения клеточных стенок и вирусных оболочек, растворения или связывания ингибиторов ПЦР (слизи, белков и др.).

2. Адсорбция органических соединений и тяжелых металлов, присутствующих в крови и других клинических материалах больного, путем добавления в лизирующие растворы смол.

3. Необратимая инактивация белков путем денатурации (протеазы, кипячение, хаотропные агенты).

4. Высаливание ДНК из водного раствора в присутствии этанола (70 %), изопропанола (50 %), (1 мкг ДНК из 50 мкл водного раствора).

5. Использование для разделения фаз вода-фенол. При этом ДНК/РНК остается в водной фазе, а белки переходят в фенольную фазу.

6. Способность ДНК/РНК связываться с частицами силикагеля. Универсальный состав сорбента позволяет связывать максимальное количество ДНК и РНК широкого спектра молекулярных масс, гарантируя получение не менее 80 % высокоактивной тотальной ДНК.

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени.

Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦР-диагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаление ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу».

Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа.

Амплификация

Амплификация в молекулярной биологии – увеличение числа копий ДНК. В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК. В искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции (рис. 2).

Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2ⁿ, где n – число циклов амплификации. Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапливается около 10⁸ молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле после соответствующего окрашивания.

Рис. 2. Схематическое изображение первого цикла ПЦР.

(1) - Денатурация при 94–96 °C; (2) - Отжиг при 68 °C; (3) - Элонгация при 72 °C (P-полимераза); (4) - Закончен первый цикл.

Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе в геометрической прогрессии. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя.

Факторы, влияющие на эффективность амплификации

1. Структура и концентрация праймеров.

2. Структура матрицы.

3. GC-состав.

4. Концентрация магния.

5. Активность ДНК-полимеразы.

6. Концентрация ДНК искомого инфекционного агента.

7. Неэффективный способ обработки биоматериала.

Одним из перспективных направлений в модификации амплификационного этапа является разработка систем, реализующих "твердофазную" амплификацию. В таких системах один из олигонуклеотидных праймеров ковалентно иммобилизован на специально модифицированном слое пластика пробирки. Получаемые в ходе ПЦР ампликоны также остаются иммобилизованными на твердой фазе, что исключает риск контаминаций и упрощает последующую процедуру их детекции. В последнее время большое внимание ученых обращено на дизайн амплификационных смесей, благодаря чему стало возможно применение мультипраймерной ПЦР, что увеличивает производительность и дает возможность выявления большего количества патогенных микроорганизмов или иных определяемых признаков, и в перспективе будет иметь большое значение при использовании в современных устройствах регистрации ДНК-биочипах.

Использование «горячего старта» при постановке ПЦР

Для оптимизации ПЦР, для повышения эффективности прохождения реакций, уменьшения риска образования неспецифических продуктов реакции амплификации используют подход, получивший название «горячий старт» (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием GC-пар и рассчитывается по следующей формуле: Tm =[(A+T) x 2] + [(G + C) х 4]. В зависимости от GC -состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm), при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Приборное обеспечение

ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1 °C, который имеет совершенные характеристики переходных температурных процессов, увеличенный ресурс работы и обеспечивает значительное сокращение времени протекания реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Характерной чертой современных амплификаторов является возможность поддержки пробирочного, планшетного и других форматов амплификации в одном приборе.

Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции и занимает от 2 до 3 часов.

Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, поэтому количество лабораторных ошибок во время анализа минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике ПЦР-лабораторий.

Регистрация результатов

Амплифицированный фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс: он внедряется в «стопку» остатков азотистых оснований ДНК, составляющую сердцевину двойной спирали. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает. Поэтому ДНК выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ светом с длиной волны 290–330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР-ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5 % до 2,5 %. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50–60 ^оС смесь заливают в форму слоем толщиной 4–6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5–1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5–10 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т.д. пар оснований. Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза (рис. 3), заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30–45 мин при напряженности электрического поля 10–15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси, должен пройти не менее 3 см.

Рис. 3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов

в агарозном геле.

Результаты оцениваются по наличию специфических фрагментов ДНК в агарозном геле. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по его положению (размерам) относительно положительного ДНК-контроля, полосы которых устанавливаются на том же уровне в геле, что и полосы в образцах с положительным контрольным препаратом ДНК, видимых в агарозном геле в присутствии бромида этидия при УФ облучении.

После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете (рис. 4) и документируют.

В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать длине ампликона, указанной в инструкции.

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие специфического сигнала в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации – загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном.

Рис. 4. Свечение продуктов ПЦР-реакции в ультрафиолетовом свете.

В последнее время особенно много внимания уделяется модификации и модернизации методов регистрации результатов ПЦР. В целом можно выделить следующие принципиальные направления:

l Внедрение систем, регистрирующих и анализирующих изображение геля в цифровом формате.

l Гибридизационные методы регистрации результатов. В основе этих методов лежит гибридизация амплифицированной ДНК со специфичным к определяемой последовательности меченым олигонуклеотидным зондом и последующая детекция двуцепочечных ДНК. Применение гибридизационной схемы в детекции амплифицированной ДНК позволяет существенно повысить специфичность анализа, а плашечный формат выполнения делает возможным максимальную стандартизацию и автоматизацию процесса, что практически исключает субъективность оценки. Переход медицинских пользователей к гибридизационному формату регистрации будет во многом способствовать и дальнейшему внедрению диагностических систем нового поколения (рис. 5).

В основе технологии ПЦР в реальном времени лежит принцип флюоресцентной детекции продуктов ПЦР во время амплификации. Такая технология дает возможность осуществлять регистрацию непосредственно в реакционной пробирке, что исключает попадание продуктов реакции в окружающую среду и контаминацию лаборатории. Детектор амплификаторов может одновременно фиксировать свет от шести флюорофоров в 96 лунках и разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение за шестью амплификациями одновременно в каждой лунке одного планшета.

Рис. 5. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального

времени (Quantitative real-time PCR).

ВОЗМОЖНОСТИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лабораторная диагностика имеет определяющее значение для установления причины инфекционного заболевания. Лабораторные исследования позволяют достоверно выяснить, каким именно возбудителем вызвано инфекционное заболевание, определить вирусную нагрузку, проследить иммунный ответ организма, правильно и своевременно назначить лечение, определить тяжесть течения болезни, проконтролировать эффективность лекарственной терапии.

При выборе метода для определения микроорганизмов, вызвавших инфекционный процесс, врачу-клиницисту надо хорошо ориентироваться в возможностях того или иного метода исследования, с тем, чтобы выбрать оптимальный подход (микробиологический, генодиагностический или иммунологический) для лабораторного исследования. Комплексное обследование пациента различными лабораторными методами дает возможность врачу-клиницисту получать более полную информацию как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе. Это позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести последующий контроль терапии.

Условно все методы диагностики инфекций можно разделить (табл. 3) на две большие группы: прямые методы (выявления возбудителя) и непрямые (выявление эффекта). Прямое обнаружение возбудителя в клиническом материале является бесспорным доказательством инфекции и основанием для постановки этиологического диагноза.

Таблица 3

Классификация лабораторных методов в зависимости от

изучаемых объектов

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Достоинства. Возможность изучения целого ряда клинически важных фенотипических свойств микроорганизмов. Микробиологический метод по-прежнему является «золотым стандартом». Такие микроорганизмы, как грампозитивные кокки (Staphylococcus spp, Streptococcus. spp), грамнегативные кокки (Neisseria spp), грампозитивные палочки (Corynebacterium spp), грамнегативные палочки (Heamophilus spp, Pseudomonas spp), грибы (Candida spp), бактерии кишечной группы (Escherichia coli, Proteus spp. и др.) выявляются с помощью традиционных, доступных и достаточно легко воспроизводимых микробиологических и микроскопических методов.

Недостатки. «Некультивируемость» микроорганизмов, отсутствие адекватных сред или невозможность подбора условий культивирования для определенных микроорганизмов (вирусы и некоторые бактерии), длительность анализа, отсутствие высокопроизводительной техники идентификации и определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, низкий уровень материальной базы бактериологических лабораторий. Ряд микроорганизмов, вызывающих воспалительные процессы в организме человека, таких как микобактерии туберкулеза, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, можно выявить только с помощью очень трудоемких и дорогостоящих методов микробиологического исследования. Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки также трудно обнаружить классическими лабораторными методами. Наконец, разнообразные вирусы, например, вирус папилломы человека (HPV), герпес вирусы (VG), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV) не могут быть выявлены с помощью микробиологических методов. Для их диагностики ПЦР-метод является оптимальным выбором.

Уровень развития микробиологической диагностики РФ остается одним из самых низких среди Европейских стран.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Этот метод, прежде всего, позволяет объективно выявлять реакцию организма человека в ответ на контакт с инфекционными агентами, выражающуюся в выработке специфических антител, обнаруживать специфический клеточный ответ, антитела IgG, IgM, IgA, а также антигены некоторых микроорганизмов.

Достоинства. Быстрота анализа, низкая стоимость, возможность стандартизации и автоматизации, достаточно высокая воспроизводимость результатов, высокая пропускная способность. Для определения некоторых микроорганизмов, например, Rubella virus иммунологический подход предпочтительнее других.

Недостатки. Непредсказуемая специфичность, необходимость в дублях при постановке реакции, необходимость наблюдения за титром антител в динамике для уточнения остроты процесса, низкая аналитическая чувствительность, поздняя сероконверсия, особенно актуальная для прямых методов ИФА «серологическое окно», перекрестные результаты ИФА у пациентов с циррозом печени, болезнями соединительной ткани, аутоиммунными заболеваниями, беременных и пожилых, а также (для косвенных методов ИФА) перекрестные результаты ИФА на антитела к другим микроорганизмам, ложноположительная реакция в случае циркуляции антител класса IgG у детей, рожденных от инфицированных матерей, вакцинации и при аутоиммунных заболеваниях.

МИКРОСКОПИЯ

Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым, так как его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител, содержащихся в качественных импортных наборах, может составлять 60 % и 80 % соответственно. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец, возможны как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты, поэтому этот метод предлагается использовать только как ориентировочный.

ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ МЕТОД (ПЦР)

Для установления точного диагноза заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, все чаще применяются современные методы молекулярной биологии.

Достоинства:

l высокая аналитическая чувствительность и специфичность;

l возможность получения результатов независимо от сложности культивирования микроорганизмов (выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций);

l специфичность и математически возможная диагностическая чувствительность;

l возможность контроля эффективности лечения;

l возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций;

l возможность ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;

l возможность диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания;

l возможность разрешения сомнительных результатов серологических и эпидемиологических исследований;

l возможность выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;

l возможность исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии;

l возможность определения резистентности к лекарственным препаратам;

l возможность диагностики возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов;

l возможность стандартизации и автоматизации анализа;

l возможность увеличения исследуемого образца ДНК в сотни раз;

l возможность проведения объективных качественных и количественных измерений;

l возможность проведения “Multiplex ПЦР” (амплификация в одной реакционной среде нескольких ДНК-матриц с использованием нескольких пар праймеров).

Недостатки:

l перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

l контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.

Преимущества ПЦР перед другими методами клинической

лабораторной диагностики

Многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что лишь опосредованно свидетельствует о наличии инфекции. При этом выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. У метода ПЦР существует ряд особенностей, большинство из которых являются несомненными достоинствами этого метода.

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов и дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы, кроме того, в качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические образцы. Наконец, вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) для его проведения используется стандартный комплект приборов.

Специфичность

Важное свойство ПЦР – ее высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Выделяют аналитическую и диагностическую специфичность. Диагностическая специфичность – число отрицательных реакций при тестировании материала образцов от больных контрольной группы (лица с подтвержденным отсутствием инфекции). Аналитическая специфичность оценивается по числу совпадений результатов с референс тест-системой, предоставляемой ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Чем специфичнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложно-положительные" результаты. Ложноположительные результаты исследования могут привести к неправильному диагнозу и назначению ненужных и, возможно, ухудшающих качество жизни пациента диагностических и лечебных процедур.

Чувствительность

ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) - последовательности в исследуемом материале.

Аналитическая чувствительность набора - это предел измерения данного ПЦР-диагностикума. Определяется в копиях ДНК или РНК на мл биологической пробы или в геномных эквивалентах ГЭ/мл. Диагностическая чувствительность – число положительных реакций при тестировании образцов от больных опытной группы с подтвержденным диагнозом.

Метод ПЦР позволяет выявлять единичные клетки бактерий или вирусов. Аналитическая чувствительность ПЦР-анализа составляет 1–100 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 10³–10⁵ клеток. Это позволяет использовать ПЦР, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра, например, при количественной (концентрация) оценке содержания НК в биологической пробе, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций.

Некоторые тест-системы допускают осуществление одновременного определения нескольких инфекций в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакции. Следует отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому рекомендуется одновременно определять не более трех инфекций за одну реакцию.

Чувствительность методов исследования приобретает особенно большое значение в случаях, когда требуется исключить наличие особо опасного инфекционного заболевания. Чем чувствительнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложноотрицательные" результаты. Ложноотрицательными называют результаты, не позволяющие выявить имеющееся у пациентов заболевание.

Сравнительная оценка диагностической чувствительности различных методов, проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах, показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60 %, ИФА – 50–70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75 %, культуральное исследование – 60–80 %, а ПЦР – 90–100 %.

Актуальность ответа (быстрота получения результата анализа)

Скорость и высокая производительность (возможность параллельного анализа большого количества образцов) являются бесспорными преимуществами данного метода.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Преимущество ПЦР в скорости получения результата по сравнению с культуральными методами особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов, при идентификации возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки, при определении лекарственной устойчивости у штаммов микобактерий туберкулеза.

Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ в течение рабочего дня.

ПЦР позволяет осуществить определение возбудителя инфекции или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде (серонегативной фазе) или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

Возможность экспертизы

Комплексное обследование пациента различными лабораторными методами дает возможность врачу-клиницисту получать более полную информацию, как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе. Это позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести последующий контроль терапии.

Исследуемый биологический материал

Материалом для ПЦР могут быть соскобы эпителиальных клеток, кровь и ее компоненты, костный мозг, плевральная, синовиальная и спинномозговая жидкости, моча и ее клеточный осадок, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, плевральный выпот, сперма, секрет простаты, желудочный сок, слезная жидкость, выделения молочных желез, смывы и другие биологические жидкости, биоптаты, секционный (аутопсийный) материалы, отделяемое везикул, фиксированные или парафинированные ткани. Биологическим материалом для ПЦР-диагностики может служить бактериальная культура, сточные воды, почва, продукты питания, корма.

Локализация возбудителей

1. Вирусные гепатиты В, С (кровь, биоптаты, соскобы, слюна).

2. Туберкулез (кровь, моча, секционный материал, мазки, мокрота, смывы, БАЛ, плевральный выпот).

3. Папилломавирусы человека (эпителий слизистой, биоптаты).

4. Трихомонады, гонококки, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, герпетические инфекции, кандиды - мазки, соскобы (со слизистых оболочек урогенитального тракта), клеточный осадок мочи. Для выявления ДНК Chlamydia trachomatis и др. инфекционных агентов, возможно также использовать мазки с конъюнктивы, синовиальную жидкость. Для выявления ДНК из герпетической группы можно использовать отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний).

5. Токсоплазма гондии (ликвор, кровь).

6. Энтеровирусы (ликвор, сточные воды, носоглоточное отделяемое, моча)

Правила забора материала и транспортировки

клинического материала для ПЦР-диагностики

1. Отбор клинического материала осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима, только стерильными одноразовыми инструментариями (шприцы, соответствующие зонды, цитощеточки и пр.), в одноразовых перчатках.

2. Максимально полно собрать материал из выбранного локуса, используя подходящие для этого аппликаторы – зонды, цитощетки (обеспечить адекватность клинического образца).

3. Сохранить полученный материал (ДНК/РНК микроорганизмов), используя надежные транспортные среды и консерванты, предоставляемые ПЦР-лабораторией. Среда для транспортировки и хранения клинического материала обеспечивает стабильность РНК и ДНК при комнатной температуре до 28 дней.

4. Поместить взятый материал в вакуэты с ЭДТА (кровь), в одноразовые химически чистые пробирки «Эппендорф» (мазки, ликвор, биоптат и др.). Основным условием при сборе материала является предотвращение попадания в пробу ДНК-аз и рибонуклеаз, т.к. рибонуклеазы и ДНК-азы – ферменты деградации РНК и ДНК. Они чрезвычайно стабильны в окружающей среде, выдерживают длительное кипячение. Основной источник нуклеаз – кожные покровы, частицы пыли. Пластиковые пробирки и наконечники должны иметь маркировку «DNase, RNase- free» (свободные от нуклеаз).

5. Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.

6. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.

7. Для исключения взаимной контаминации образцы хранить и транспортировать в отдельном полиэтиленовом пакете или штативах. При необходимости переноса образца использовать автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками с аэрозольными барьерами.

8. До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранить при температуре 2–4 °С не более 48 часов. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа. Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

Кровь, плазма, сыворотка

Забор крови рекомендуется проводить с использованием вакуумных систем. Внедрение таких систем позволяет стандартизировать манипуляции с кровью, положительно сказывается на всех этапах лабораторного исследования и в целом переводит работу лаборатории на иной, более высокий уровень качества. Их использование гарантирует защиту персонала от инфицирования, сокращается время, затрачиваемое на процедуру забора крови, значительно реже сопровождается гемолизом, позволяет сохранить стерильность проб крови и герметично транспортировать.

Венепункцию рекомендуется выполнять натощак из локтевой вены в специальную вакуумную пробирку с антикоагулянтом, после чего пробирка переворачивается для перемешивания несколько раз. Пробирки с кровью хранят в холодильнике при +4 °С – +8 °С. Максимальный срок хранения крови – 1 сутки (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16^о-20 ^оС не более 2 недель.

Характеристика вакуумных систем, используемых для ПЦР-диагностики:

1. Вакуэты с ЭДТА (6 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. ЭДТА-антикоагулянт хорошо фиксирует нуклеиновые кислоты клетки.

2. Вакуэты с цитратом натрия (3,8 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. Не подходят для длительной транспортировки, т.к. цитрат является хорошей питательной средой для посторонней микрофлоры.

3. Вакуэты без антикоагулянтов (сыворотка крови) – используются для проведения качественных исследований. Использования сыворотки крови для количественных исследований нежелательно, т.к. часть инфекционного агента оседает в сгустке крови, при этом снижается возможность определения количественного содержания его в крови.

4. Вакуэты с гепарином - категорически не подходят для ПЦР - реакции. Гепарин является полианионом, как и ДНК, поэтому в ПЦР-реакции конкурирует с ДНК.

Соскоб с эпителиальных клеток для выявления ДНК возбудителей инфекций, передающихся половым путем

У мужчин материалом для скрининга на ИППП служат соскобы из уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, помещенные в 300 мкл транспортной среды, секреты предстательной железы. Достаточно информативным является исследование у мужчин методом полимеразной цепной реакции осадка первой порции утренней мочи. У детей материал берут с наружного отверстия уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, мазки с конъюнктивы.

Для скрининга на ИППП у женщин исследуют соскоб (мазок) из уретры, цервикального канала, нижнего свода влагалища, осадки клеток первой порции утренней мочи, которые помещаются в транспортную среду. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на герпетическую группу). В некоторых случаях для диагностики можно использовать образцы выделений из влагалища, в том числе взятые тампоном самостоятельно без посещения кабинета забора клинического материала. Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, с наружного отверстия уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, мазки с конъюнктивы.

Факторы, влияющие на эффективность выявления урогенитальных патогенных микроорганизмов с помощью НК

Причинами ингибирования ПЦР-реакции могут быть:

1. Наличие цервикальной слизи в клиническом материале (частой причиной патологических выделений могут быть воспаления, ассоциированные с бактериальным вагинозом и инфекционной патологией: кандидоз, трихомоноз, хламидийная или гонококковая инфекции).

2. Гемоглобин.

3. Гепарин.

4. Слизь (мукополисахариды).

5. Ионы металлов (Сa²⁺, Fе³⁺).

6. Соли.

7. Билирубин и желчные кислоты.

8. Гормоны.

9. Ферменты.

10.Иммуноглобулины.

11.Продукты жизнедеятельности микроорганизмов.

Правила подготовки больного для ПЦР-диагностики

урогенитальных инфекций

1. За 5–7 дней до приема необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры.

2. Рекомендуется воздерживаться от мочеиспускания в течение 1,5–2 часов и более перед взятием материала.

3. Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи.

4. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокацию. Забор материала производят после провокации и через 24–48–72 часа.

5. Взятие материала должен производить врач акушер-гинеколог при подозрении на инфекционную природу патологического процесса.

6. Контроль проведенной терапии следует проводить через 3–4 недели после окончания химиотерапии. Полная элиминация ДНК происходит в период от 2-х до 3-х недель.

7. Оптимальным для персистенции и размножения возбудителей ИППП являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5–4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки 1,5 см у женщин).

8. При взятии соскоба из уретры у мужчин необходимо обработать область наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, после чего зонд осторожно вводят на глубину 1–4 см и совершают одно–два вращательных движения, производя соскоб эпителиальных клеток, и переносят зонд в пробирку с транспортной средой.

9. Для получения материала из уретры у женщин – зонд осторожно вводят на глубину 1 см и совершают одно–два вращательных движения, после чего зонд извлекают.

10.При взятии материала из шейки матки ключевым моментом является удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит возможность правильного соскоба из цервикального канала. Слизистую пробку удаляют стерильным ватным тампоном на стерильном пинцете, обрабатывают шейку матки стерильным физиологическим раствором и затем берут материал цитощеточкой cervex brush или voba–brush. Ее использование имеет ряд преимуществ, поскольку для получения информативного результата важно присутствие в соскобе клеток со всей поверхности шейки матки, цервикального канала, зоны трансформации и наружной части шейки матки. Щеточка вводится в канал на глубину 0,5–1 см и вращается примерно 15 секунд (одно–два вращательных движения) после чего извлекается.

11.У женщин для выявления трихомонад, гонококков и гарднерелл, а также для интегральной диагностики бактериальных вагинозов также рекомендуется брать материал из заднего свода влагалища.

12.Материал рекомендуется набирать в одноразовую стерильную пробирку (“Эппендорф” 1,5 мл) или в пробирку с 500 мкл транспортной среды. Она содержит компоненты для растворения слизи, угнетения роста посторонних микроорганизмов, стабилизирует ДНК/РНК возбудителей, а также контролирует рН среды (женская среда). Применение транспортной среды обеспечивает качество на преаналитическом этапе, так как позволяет хранить клинический материал при +25 ^оС в течение 28 суток.

13.По Европейским стандартам диагностики заболеваний, передаваемых половым путем, для ПЦР–методов используется материал, полученный как инвазивным – из уретры, так и неинвазивным способом – первая порция мочи.

14.Объектом исследования на наличие возбудителей ИППП могут быть также смывы со слизистой оболочки глаз, носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж.

Мазок с конъюнктивы, слизистой зева и дыхательных путей

Забор материала производится рабочей частью стерильного одноразового аппликатора. Слегка проводят им 1–2 раза по слизистой в местах предполагаемой локализации инфекционного агента. После забора материала аппликатор помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Тщательно перемешивают, остатки жидкости на зонде отжимают о стенки пробирки, аппликатор извлекают (выбрасывают в контейнер с дезинфицирующим раствором) или отрезают, оставляя рабочую часть в пробирке с транспортной жидкости. Приготовленную таким образом пробу передают в лабораторию. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8 °С.

Моча

Первая порция утренней мочи в количестве 10 мл собирается в специальный флакон или пробирку без консервирующего раствора. Использование домашней посуды вместо специальных контейнеров и пробирок приводит к контаминации проб, получению заведомо ложных результатов и невозможности стандартизации.

Максимальный срок хранения отобранного материала - одни сутки в холодильнике при температуре +4 °С.

Мокрота

Мокроту собирают утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10-15 мл после проведенного инструктажа по забору материала в домашних условиях, либо в ЛПУ под контролем медперсонала. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4 °С – +8 °С.

Синовиальная жидкость

Забор материала производится одноразовым шприцом в количестве 1 мл. Отобранный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”.

Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4 °С – +8 °С.

Другие биологические жидкости

Секрет простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям стандартным способом с использованием стерильного (одноразового) инструментария в количестве 0,1–1,0 мл в стерильные разовые пробирки с плотно закрывающимися крышками.

Секционный материал

Кусочки органов или ткани объемом примерно 2–3 мм³ помещают в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл.

Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4 °С – +8 °С.

Применение метода ПЦР в медицине

С помощью лабораторных данных 60–80% всех медицинских решений клиницисты принимают по результатам клинико-лабораторных исследований. Лабораторные данные позволяют врачу увереннее проводить разработку плана обследования и лечения пациента, вести наблюдение за эффективностью терапии.

Диагностическое значение ПЦР-исследований в клинике

инфекционных заболеваний

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет иногда большое значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии, способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных и наследственных заболеваний. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР (табл. 4).

Таблица 4

Локализация возбудителей и диагностическое значение ПЦР

Особое место в этом ряду занимают вирусные инфекционные агенты и микобактерии туберкулеза. ПЦР открывает поистине фантастические возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям.

Особенности вирусной природы заболевания обуславливают определенные трудности их диагностики, лечения и профилактики. Весьма актуальной проблемой является адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов. В настоящее время известно как минимум пять вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. Существуют и другие вирусы, поражающие печень, однако при этом печеночная ткань не является местом первичной репликации вируса и поражения гепатоцитов. К таким вирусам относятся: цитомегаловирус (CMV), вирус простого герпеса (ВПГ), вирус Эпштейна-Барр (EBV) и многие флавивирусы, переносимые членистоногими, например, вирус, вызывающий лихорадку Денге и желтую лихорадку. Этиологическая роль HGV и вируса TTV в развитии хронического гепатита сомнительна. Их способность специфически поражать гепатоциты подвергается сомнению, т.к. в литературе описаны только отдельные случаи вызванного ими гепатита, в то время как частота бессимптомного носительства этих вирусов в популяции очень высока.

Наибольшую угрозу для здоровья населения представляют вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи HCV, HВV, НDV.

Эти инфекции характеризуются тяжелым клиническим течением, являясь частой причиной хронического гепатита. Установлено, что длительное персистирование этих вирусов в гепатоцитах является решающим фактором их малигнизации.

Для надежного доказательства вирусного гепатита, в т.ч. “молчащих” форм инфекции, для оценки эффективности терапии применяются молекулярно-биологические методы, обладающие высокой дискриминативной способностью, направленные на поиск специфичных молекулярных маркеров.

Гепатит А (HАV), Е (HЕV)

Для гепатитов HАV и HЕV не характерно развитие хронического (протекающего больше 6 мес.) заболевания печени.

Вирусы гепатита А и Е передаются фекально-оральным путем и чаще всего обнаруживаются в местах с плохими санитарными условиями.

Дата добавления: 2015-02-05 | Просмотры: 837 | Нарушение авторских прав