АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Забор мокроты для анализа

Для сбора мокроты применяют одноразовые плевательницы или специальные контейнеры емкостью около 50 мл с герметично закрывающимися крышками. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состояние собранного материала, не открывая крышку контейнера. Забор мокроты необходимо проводить в специально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, локальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты. Если условия этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет посторонних людей. На исследование направляют 3 пробы мокроты от каждого пациента:

1-я проба – пациент под наблюдением медицинского работника собирает мокроту, накопившуюся в течение 1-2-х часов после сна.

2-я проба – мокрота собирается больным в тот же день через некоторое время после взятия первой пробы.

3-я проба – мокрота собирается больным на следующее утро и доставляется в медучреждение.

Медицинский работник должен работать в респираторе, резиновых перчатках и резиновом фартуке. Перед сдачей мокроты больной должен прополоскать рот для удаления из полости рта остатков пищи и контаминирующих бактерий. Пациенту предлагают отхаркнуть мокроту из глубины легких, для чего он должен сделать два глубоких вдоха, задержать дыхание на несколько секунд поле каждого вдоха и затем медленно выдохнуть, после третьего вдоха с силой выдохнуть воздух и после еще одного вдоха покашлять. После появления продуктивного кашля мокрота аккуратно сплевывается в поднесенный к губам контейнер. Для исследования необходимо получить достаточное количество (3-5 мл) мокроты, содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну. Собранная мокрота должна быть доставлена в лабораторию для исследований в плотно закрытом промаркированном контейнере, помещенном в бикс для транспортировки. Микробиологическая диагностика туберкулеза включает рутинные (бактериоскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ) автоматические системы (MGIT, BACTEC, MB/BacT, ESP Culture System и др.), молекулярно-генетические (PCR, LCR, NASBA, Q-Beta и др.), аллергический метод.

При бактериоскопии берут гнойные частицы, из которых готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену. МБТ в мазках представляют собой тонкие, слегка изогнутые палочки, окрашенные в ярко-красный цвет, фон препарата голубой. Микроскопия мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, не доказывает их безусловную принадлежность к МБТ, т.к. за МБТ ошибочно могут быть приняты типичные сапрофитные микроорганизмы. Разрешающая способность метода составляет 50-100 тысяч микобактерий в 1 мл мокроты. Можно использовать люминесцентную микроскопию, основанную на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при УФО. В зависимости от красителей МБТ дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Люминесцентная микроскопия обладает большей разрешающей способностью по сравнению с окраской по Цилю-Нильсену и дает возможность обнаружить микобактерии туберкулеза при наличии 500-1000 микробных тел в 1 мл материала. Люминесцентная микроскопия позволяет находить измененные микобактерии (особенно в конце антибактериального лечения), не дающие роста на питательных средах. Однако метод люминесцентной микроскопии не дает возможности точно дифференцировать исследуемые МБТ от сапрофитов и не гарантирует от возможных ошибок.

Бактериоскопия мочи, спермы, менструальной крови с целью выявления микобактерий туберкулеза не гарантирует от ошибочных результатов. Данные бактериоскопии являются ориентировочным методами и требуют непременного подтверждения культуральными методами.

Однако метод бактериоскопии обязателен в комплексе бактериологических исследований, т.к. он дает возможность получить ориентировочный результат в течение 1-2 дней, определить массивность бактериовыделения и выявить измененные, утратившие способность к росту на питательных средах микобактерии туберкулеза.

Культуральное (бактериологическое) исследование на МБТ благодаря высокой чувствительности (10-100 микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Наиболее результативным является посев материала на 2-3 питательные диагностические среды с разным составом (Финн II, Левенштейна-Йенсена, среда Полеску, среда

№ 6, № 9, среда Аникина, Сотона и др.). Перед проведением посева поступившие в лабораторию пробы обрабатывают 2-5% серной кислотой или равным объемом трифосфата ацетилцистеина или 10% раствором тринатрийфосфата для разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средами (яичные и агаровые) и инкубируют при 37^оС в течение 10 недель. Применение комплекса из трех питательных сред увеличивает результативность выявления МБТ в патологическом материале. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета (чешуйки, бородавки, цветная капуста – R-формы). На агаровых средах рост МБТ появляется через 10-14 дней. При выделении культуры микобактерий обязательно проводится видовая идентификация, позволяющая дифференцировать типичные МБТ от атипичных микобактерий и кислотоупорных сапрофитов и тем самым подтвердить туберкулез или выявить нетуберкулезную природу заболевания. Для установления видовой принадлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов: способность штамма микобактерий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуцировать уреазу и проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазная активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме этого, для идентификации микобактерий используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах, способность микобактерий образовывать корд-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при разных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, пара-нитробензойную кислоту или салициловокислый натрий. Ответы на положительные посевы выдаются по мере выхода культур, при отсутствии роста в течение 75-90 дней инкубации. Важным аспектом бактериологической диагностики туберкулеза является определение лекарственной чувствительности микобактерий. Для определения лекарственной чувствительности МБТ используются 3 основных метода: метод абсолютных концентраций, метод соотношения резистентности и метод пропорций. Метод абсолютных (предельных) концентраций заключается в выращивании микобактерий на питательных средах, содержащих различные концентрации противотуберкулезных препаратов (ПТП). При прямом способе этого метода используется посев на среды с ПТП патологического материала, при непрямом способе – выделенных культур микобактерий. Прямой способ значительно ускоряет получение результата, но им можно пользоваться только тогда, когда МБТ содержатся в исследуемом материале в значительном количестве и обнаруживаются в нем бактериоскопически. Определение лекарственной чувствительности может проводиться на плотных (среда Левенштейна-Йенсена без крахмала) и жидких питательных средах. Результат на плотных средах учитывают через 3 недели по макроросту МБТ на поверхности среды, на жидких средах – по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка через 10-12 дней. Метод соотношения резистентности заключается в определении соотношения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ПТП для тестируемого штамма и референс-штамма H₃₇ R_V, чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует штамм как чувствительный, 8 и более – как устойчивый. Вариантом этого метода является Е-тест. Лекарственная устойчивость МБТ определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций ПТП. Чувствительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны задержки роста микобактерий вокруг полоски (время определения 5-10дней). Метод пропорций заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде с ПТП, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции резистентных бактерий в популяции (не находит широкого применения из-за его трудоемкости).

Автоматические системы. Для быстрой детекции микобактерий и определения лекарственной чувствительности широко используются автоматические системы.

Они позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем при использовании классических методов. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах.

При наличии вивария в комплексе с другими методами обследования можно использовать биологический метод (заражение морских свинок), при котором даже при наличии 10 микробных тел в 1 мл диагностического материала можно получить туберкулез у животных. Подключение биопробы рационально при исследовании менструальной крови и эякулята от больных с предполагаемым туберкулезом кожи. Учитывая, что не во всех порциях патологического материала может быть возбудитель, целесообразно заражение животных производить три дня подряд ежедневными порциями патологического материала.

Возбудитель туберкулеза вызывает у животных уплотнение на месте инъекции, переходящее в язву, увеличение регионарных лимфоузлов, гибель животных в результате генерализации процесса: непатогенные бактерии не вызывают гибель животных. Для подтверждения диагноза делают мазки-отпечатки из печени, легких, селезенки, лимфоузлов, окрашивают их по Цилю-Нильсену. Кроме того, готовят гомогенизат указанных органов и высевают его на питательные среды.

Для определения инфицирования организма микобактериями применяют аллергический метод (внутрикожную пробу с туберкулином (реакция Манту)).

В настоящее время существует молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на выявлении фрагментов ДНК, являющихся специфическими для возбудителя туберкулеза. Данный метод превосходит по чувствительности бактериологический метод в 1,6-1,7 раза и позволяет определять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала.

Принцип метода ПЦР состоит в амплификации, т. е. в миллионы раз умножении участков специфической последовательности ДНК микобактерий туберкулеза в пробирочном микрообъеме.

Значение этого метода для обнаружения МБТ обусловлено биологическими особенностями возбудителя, обладающего очень медленным ростом (время удвоения ДНК микобактерий туберкулеза при их культивировании составляет 12-24 часа).

Дата добавления: 2015-09-18 | Просмотры: 1760 | Нарушение авторских прав