АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Качественные пробы на присутствие ферментов

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Получение препаратов ферментов

1. Получение сахаразы из дрожжей

Сахараза (К.Ф. 3.2.1.4.) катализирует гидролитическое расщепление гликозидной связи в молекуле сахарозы, при этом образуется глюкоза и фруктоза. Глюкозу обнаруживают реакцией Фелинга.

Ход работы. В фарфоровую ступку вносят 1 г прессованных пекарских дрожжей и тщательно растирают в 3 мл воды в течение 5 мин. Затем добавляют 17 мл воды, перемешивают и ставят ступку в термостат при 37 ˚С на 20 мин. Через каждые 5 мин содержимое перемешивают. По истечении указанного времени массу фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отфильтрованная вытяжка содержит фермент сахаразу

2. Получение препарата цитохромоксидазы из мышечной ткани

Скелетные мышцы (50 – 80 г) тщательно измельчают ножницами, заливают четырехкратным объемом дистиллированной воды и гомогенизируют в гомогенизаторе в течение 10 мин. Гомогенат фильтруют через двойной слой марли и многократно промывают водой до тех пор, пока промывные воды перестанут быть окрашенными. Полученная почти бесцветная кашица содержит цитохромоксидазу, комплекс цитохромов и некоторые дегидрогеназы.

Качественные пробы на присутствие ферментов

1. Открытие пероксидазы (донор: Н₂О₂- оксиредуктаза;КФ 1.11.1.7) в картофеле

Оборудование, реактивы. Тёрка; сырой картофель; пирогаллол (1%-ный); перокснд водорода (2%-ный).

Ход работы. Картофель натирают на терке. Небольшое его количество, не отжимая, переносят в пробирку, добавляют 1—2 мл 1%-ного раствора пирогаллола и 1—2 капли 2%-ного раствора пероксида водорода. При стоянии выпадает желто-бурый осадок пурпурогаллина. Образование пурпурогаллина выражает следующая схема 1. Многократное дегидрирование (окисление) пирогаллола и ряда промежуточных продуктов на пути к пурпурогаллину осуществляется с участием пероксидазы, каждый раз передающей снятые атомы водорода на пероксид водорода.

Схема 1. Образование пурпурогаллина.

2. Открытие альдегидоксидазы (альдегид:О₂- оксиредуктаза; КФ 1.2.3.1) в сыром молоке

Оборудование, реактивы; баня водяная, термометр, пипетки на 1 мл (3 шт.), на 5 мл – 2 шт; свежее коровье молоко, формальдегид (0,4 %-ный), метиленовый синий (0,01 %-ный).

Ход работы: В три пробирки наливают по 5 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят 2-3 мин. и остужают. В другую пробирку добавляют 1 мл 0,4 %-ного формальдегида, в 3-ю – 1 мл воды. Затем во все три пробирки наливают по 1 мл 0,01 %-ного раствора метиленового синего. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и заливают в каждую по 3-4 капли вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха. Все пробы помещают в водяную баню, нагретую до 40 ^оС. Через некоторое время жидкость в некипяченой пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего:

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть на воздухе, то раствор вновь приобретает синий цвет.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 814 | Нарушение авторских прав