Групповая принадлежность крови по системе АВО определяется с помощью реакции агглютинации. В настоящее время используют три способа определения групп крови по системе АВО:
• по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам,
• по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам и стандартным эритроцитам (перекрестный способ),
• с помощью моноклональных антител (цоликлонов анти-А и аити-В).
При плановом исследовании врач стационара определяет группу крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам или с помощью цоликлонов, после чего посылает кровь в серологическую лабораторию для проверки группы перекрестным методом.
Группа крови считается определенной только тогда, когда лаборатория подтвердила данные, полученные врачом стационара. Если результаты исследований расходятся между собой, оба исследования нужно повторить.
В экстренном порядке (при кровотечении необходимо срочное переливание крови), врач стационара определяет группу сам (в лаборатории перепроверка производится, но постфактум).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ ПО СТАНДАРТНЫМ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИМ СЫВОРОТКАМ
Наиболее распространен в клинической и лабораторной практике.
Суть метода сводится к обнаружению в испытуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Проводят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.
а) Необходимое оснащение
• Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О (I), А (II), В (III) и АВ (IV) двух различных серий. Сыворотка должна быть прозрачной, без признаков гниения. Для удобства стандартные гемагглютинирующие сыворотки различных групп подкрашивают в определенный цвет: О (I) — бесцветная (серая), А (II) — синяя, В (III) — красная, АВ (IV) — ярко-желтая. Следует отметить, что указанные цвета сопутствуют всем этикеткам на препаратах крови, имеющих групповую принадлежность (кровь, эритроцитная масса, плазма и др.).
• Белые фарфоровые или эмалированные тарелки или любые другие пластинки со смачиваемой поверхностью, маркированные 0(1), А(П), В(Ш), AB(IV).
1. На тарелку (пластинку) наносят стандартные изогемагглютииирующие сыворотки I, II, Ш групп в объеме 0,1 мл (одна большая капля около 1 см в диаметре). Во избежание ошибок наносят две серии сывороток каждой из групп. Всего получается 6 капель.
2. Шесть капель исследуемой крови величиной приблизительно с булавочную головку 0,01 мл (маленькая капля) последовательно переносят сухой стеклянной палочкой на пластину в 6 точек, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки), потом их осторожно с помощью стеклянных палочек с закругленными краями перемешивают.
3. После смешивания тарелку периодически покачивают.
Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд.
4. В те капли, где произошла агглютинация, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результат реакции.
При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунд в смеси появляются видимые невооруженным взглядом мелкие красные зернышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов.
Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что испытуемая кровь содержит оба агглютиногена — А и В и принадлежит к группе AB(IV). Однако в таких случаях для исключения неспецифической реакции агглютинации (холодовая агглютинация, пангглютинация, аллергия) необходимо провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной изогемагглютинирующей сывороткой группы AB(IV), не содержащей агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле при наличии агглютинации в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп 0(1), A(II) и B(III), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ0 (IV).
Следует отметить, что при наличии в исследуемой крови слабого подтипа антигена А, реакция агглютинации с гемагглютинирующими сыворотками групп 0(1) и В(Ш) начинается позже (на 3-4 минуте). Для точного определения подтипа антигена А необходимо проведение дополнительной реакции с так называемым анти-А, реактивом.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ ПО СТАНДАРТНЫМ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИМ СЫВОРОТКАМ И СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИТАМ (ПЕРЕКРЕСТНЫЙ СПОСОБ)
Способ наиболее часто используется в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изо-гемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител а и b с помощью стандартных эритроцитов.
• Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для реакции агглютинации необходимы стандартные эритроциты трех групп крови: 0(1), А(II), В(III).
• Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8°С.
На маркированную тарелку пипеткой в шесть ячеек наносят по одной большой капле сыворотки исследуемой крови из пробирки (0,1мл), а рядом с ними — по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп 0(1), А(П), В(Ш) (по две серии).
Особенностью трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами является то, что эритроциты группы 0(1) являются контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ
Для определения группы крови используются моноклональные антитела, для получения которых применяется гибридомная биотехнология.
Гибридома — это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.
Разработаны стандартные реагенты — моноклональные антитела (МКА): цоликлоны анти-А и анти-В, которые применяют для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны представляют из себя лиофилизированный порошок красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, который разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием.
Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А или анти-В. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле (0,01мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА
В 1940 г. К. Ландштейнер и А. С. Винер обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а 15% лиц этого фактора не содержат. Так он назван, по имени макаки Резус, у которой он всегда имеется.
Антигены резус относят к липопротеидам. Они являются очень активными и способны вызывать образование иммунных антител.
Наличие резус-антигена выявляется у человеческого плода начиная с 5-8 недели и хорошо выражено у 3-4-месячного эмбриона.