 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Клетку (перитонеальный макрофаг)(Практическая часть занятия) Цель опыта: приобрести навыки выделения и работы с первичной культурой клеток. Изучить влияние повреждающего действия активных форм кислорода на мембранные структуры клетки.
Приборы и материалы: 1 мышь весом 15-20 гр., лоток, бикс, препаровальный столик, булавки, ножницы глазные, пинцет анатомический, шприц инсулиновый, шприц 5 мл, камера Горяева, микроскоп, пипетки лабораторные, штативы пробирочные и для эппендорфов, эппендорфы, маркер. Реактивы: физиологический раствор, хлоралгидрат из расчета 35 мг/100 г веса, синь трепановая, пероксид водорода 3%, бензоат натрия. Ход работы: 1. Наркотизируем мышь.
Для этого берем мышь большим и указательным пальцами за хвост, ближе к основанию и сажаем ее на клетку или ровную поверхность. Прижимаем мышь безымянным пальцем, приподнимаем хвост и делаем укол инсулиновым шприцом (0,1 мл р-ра хлоралгидрата) в нижнюю часть живота, стараясь не проникать иглой глубоко.
2. Закрепляем мышь на препаровальном столе булавками. Пинцетом аккуратно подхватываем и приподнимаем шкурку немного ниже грудины.
7. Собранную взвесь клеток центрифугируем 4 мин при 1000 оборотов/мин 8. Удаляем надосадочную жидкость пипеткой, доводим объем до 1 мл физ раствором, затем пипетируем (взбалтываем пипеткой) взвесь клеток. Эта взвесь клеток представляет собой ПЕРВИЧНУЮ КУЛЬТУРУ КЛЕТОК. 9. Помечаем эппендорфы: контроль 1/1 как «К1/1», контроль 2/1 как «К2/1», пероксид водорода 1/1 как «ПВ1/1» и пероксид водорода 2/1 как «ПВ2/1». Собираем камеру Горяева. 10. Отливаем пипеткой 100 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 1/1, добавляем 100 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева (См. ПРОТОКОЛ ниже). Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетрадь. 11. Отливаем пипеткой 67 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 2/1, добавляем 134 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетради. 12. В третий эппендорф с пометкой пероксид водорода 1/1 наливаем 100 мкл взвеси клеток+ 100мкл р-ра пероксида водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 1.5% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь. 13. В четвертый эппендорф с пометкой пероксид водорода 2/1наливаем 67 мкл взвеси клеток+ 134 мкл р-ра перекиси водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 2% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь.
Нормальные макрофаги (указано стрелкой) Поврежденные макрофаги (указано стрелкой) Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 644 | Нарушение авторских прав |
