АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Световая (оптическая) и электронная микроскопия

В течение последних 200 лет световая микроскопия является одним из основных инструментов для исследователей, работающих в области цитологии, гистологии, эмбриологии и многих других биологических и медицинских дисциплин, причем в последние десятилетия ее применение неуклонно расширяется.

Рис. 1. Схема основных элементов светового микроскопа (А) и электронных микроскопов: просвечивающего (Б) и сканирующего (В).

Принцип работы обычного светового и электронного микроскопов нами изучен ранее, поэтому сосредоточимся на особенностях исследования биологических объектов с помощью данных приборов и методах подготовки препаратов для них.

Этапы подготовки препаратов для исследования на световом и электронном микроскопах:

Образцы органического происхождения можно исследовать как прижизненно, так и фиксированными. Во втором варианте объект можно поделить на несколько частей для более подробного изучения, из него изготавливаются либо временные, либо постоянные препараты

· Фиксация препаратов:

Фиксация — это метод сохранения образца в наиболее приближенном к его естественному состоянию. Для того чтобы в кратчайших сроках умертвить ткани исследуемого объекта используют специальный препарат, называемый фиксатором (обычно, фиксатором является газообразное вещество). Метод фиксации позволяет достигнуть сохранения образца с его первоначальной структурой, при этом происходит уплотнение тканей, вследствие чего представляется возможным изготовить срезы с минимальной толщиной.

· Обезвоживание препаратов:

Смысл процесса обезвоживания в том, чтобы подготовить образец к заливке, либо поместить его в среду, не смешивающуюся с водой. Из материала удаляется вода для предотвращения его разрушения и взаимодействия с микроорганизмами. Для максимального сохранения структуры, процедуру обезвоживания проводят поэтапно: обрабатывают ткани сначала водными растворами пропанона (ацетона) или этанола с постепенно возрастающей их концентрацией, затем заканчивают обрабатывать безводным пропаноном или этанолом.

· Просветление препаратов:

Так как большинство из применяемых заливочных сред не смешиваются со спиртом, его медленно замешивают с просветляющим веществом – такой средой, смешение которой с заливочной смесью возможно, например, используют ксилол. Одним из последствий просветления является то, что образец становится прозрачным.

· Заливка препаратов:

На этом этапе материал заливают в специальную опорную среду, чтобы была возможность в дальнейшем сделать его тонкий срез с помощью микротома. Здесь приготовление препаратов для световой микроскопии отличается от того же процесса для электронной микроскопии. Для исследовании на оптическом микроскопе препараты заливают в парафин, который затем застывает, для электронного же микроскопа в качестве заливочных сред используют смолы либо пластмассы, так как они более твердые, ведь для такого микроскопа требуются более тонки срезы материала, соответственно и опоры нужна более плотная.

ü Различия в подготовке образцов для исследования на световом и электронном микроскопах:

· Приготовления срезов препаратов:

Обычно толщина частей материала слишком велика, поэтому он не может пропустить достаточное количество света. Для преодоления этой проблемы срезают слой материала нужной толщины, называемый срезом. Срезы выполняют либо бритвой, либо на микротоме. Если срезы делаются вручную, то их изготавливают с помощью остро наточенной бритвы. Толщина срезов для работы с оптическим микроскопом должна быть примерно 8—12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани.

Срез материала, залитого в некоторую среду, можно выполнить на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров делают с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. Так же можно приготовить срезы, не заливая материал в среду, используя замораживающий микротом. В результате приготовления замороженного среза препарат сохраняется в твердом (замороженном) состоянии. Для электронного микроскопа изготавливают тончайшие срезы (20—100 нм) на ультратоме. В этом случае необходимо использовать алмазный либо стеклянный нож.

· Окрашивание препаратов:

Окрашивание используют из-за того, что биологические объекты в результате нескольких этапов приготовления препаратов становятся прозрачными, и контраста между структурами не наблюдается. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в таблице.

Табл.1. Этапы обработки препаратов для световой и электронной микроскопии.

Некоторые красители в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живого материала. Их называют прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся, например, метиленовый синий и нейтральный красный.

При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез перед окрашиванием частично обводняют. Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол; она не пропускает воздух, так что срез может сохраняться в ней неограниченно долго, затем срез накрывают покровным стеклом. Последовательность описанных выше действий типична, когда речь идет о приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:

а) если срез сырого материала готовят вручную, то сначала делают срез, а потом его фиксируют;

б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо его стадии.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1929 | Нарушение авторских прав