АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Теоретические сведения

Практическая работа № 4

Устройство и принцип работы светового микроскопа. Микроскопия биологических образцов

Цель работы: изучить структуру и принцип работы светового микроскопа; подготовить образцы крови и провести микроскопию; проанализировать результаты и сделать выводы о проведенной работе.

Теоретические сведения.

УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА

Изучение невидимых невооруженным глазом клеток микроорга­низмов, размеры которых не превышают десятков и сотен микрометров (1 мкм = 0,001 мм), возможно только при помощи микроскопов. Эти приборы позволяют получать в сотни раз (световые микроскопы) и десятки-сотни тысяч раз (электрон­ные микроскопы) увеличенное изображение исследуемых объектов.

При помощи микроскопа изучают морфологию клеток микроорга­низмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию исследуемых организмов, ведут наблю­дения за характером роста клеток.

Микроскоп состоит из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).

Механическая часть микроскопа. К ней относят штатив, предметный столик и тубус (труба). Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. К нему примыкает коробка механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометренного и микрометренного винтов.

Макрометренный винт (макровинт) служит для предварительной, ориентировочной установки изображения рас­сматриваемого объекта на фокус.

Микрометренный винт (микровинт) используют для последующей, более четкой установки на фокус. При полном повороте микрометрен­ного винта тубус передвигается на 0,1 мм (100 мкм). При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается по направлению к препа­рату, при вращении против нее идет от препарата.

На предметный столик помещают препарат с объектом исследова­ния. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно пер­пендикулярных плоскостях при помощи винтов. В центре столика находится отверстие для освещения препарата снизу лучами света, Направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) - пружинящие металлические пластинки, предназна­ченные для закрепления препарата.

Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (это важно при подсчете), или если во время работы требует­ся повторное наблюдение какого-либо определенного участка препара­та, на предметный столик помещают препаратоводитель. На этом приспособлении имеется система линеек - нониусов, при помощи которых можно закоординировать любую точку исследуемого объекта. Для этого при установке препаратоводителя совмещают центр враще­ния столика и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя по кресту (отсюда предметный столик с препаратоводителем называют иногда крестообразным).

Тубус - это оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней его части прикрепляют револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные моде­ли микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.

Оптическая часть микроскопа. Она состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической и осветительной систем строго центрированы в отношении друг друга. Во многих со­временных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтирован­ным в прибор регулируемым источником света.

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая - вогнутая. При работе с конденсором необхо­димо пользоваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало приме­няют при работе без конденсора с объективами малых увеличений.

Конденсор состоит из двух- трех короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонти­рованы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механиз­мом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом.

Для регулирования интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповид­ных пластинок. Чтобы получить более четкое изображение исследуемо­го объекта, регулируют степень раскрытия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диа­фрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стекла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив - наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная систе­ма, от качества которой зависит в основном изображение объекта.

Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называет­ся фронтальной, она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.

Один из таких недостатков следствие явления сферической аберрации. Это явление связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по-разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

К о бъективам, устраняющим сферическую аберрацию и частично хроматическую, относятся ахроматы. Они содержат до шести линз, корректируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), но не устраняют вторичного спектра. Объективы, устраняющие хроматиче­скую аберрацию и для вторичного спектра, называются апохроматами. В их составе может быть до 12 линз. В объективах-планахроматах и планапохроматах скорректированы и сферическая, и хроматическая аберрации. Их используют при микрофотографировании.

Апохроматы дают возможность устранить окрашивание объекта и получить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Мак­симального эффекта при работе с апохроматами можно достичь, одновременно используя компенсационные окуляры, возмещающие оптические недостатки объективов. Хроматическая ошибка таких окуляров обратна хроматической ошибке объектива. В результате хроматическая аберрация микроскопа оказывается почти полностью компенсированной.

Объективы бывают сухие и погружные, или иммерсионные. При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Оптический расчет иммер­сионных объективов предусматривает работу с ними при погружении фронтальной линзы объектива в однородную жидкую среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис. 1).

При работе с иммерсионным объективом между покровным стек­лом и линзами объектива помещают кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Послед­нее время иммерсионной жидкостью чаще служат синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу. Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют направления. На оправе иммерсионных объективов есть черная круговая нарезка и обозначения: I-(иммерсия), Н1 - (однородная иммерсия), OI -масляная иммерсия. Объективы различают по увеличению. Собственное увеличение объективов определяют по формуле V=l/f.

Рис. 1. Ход лучей в сухой и иммерсионной системах

где l - оптическая длина тубуса, или расстояние между фокальной плоскостью
объектива и плоскостью изображения; для разных объективов оно колеблется в
диапазоне 128...180мм; f - фокусное расстояние объектива. Чем больше фокусное
расстояние, тем меньше увеличение объектива.

Обозначения увеличений объективов наносят на их оправу. Каждый
объектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего расстояния в миллиметрах.

У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата (объекта) больше, чем у объективов с большим
увеличением. В связи с этим необходимо строго следить, каким винтом - макрометренным или микрометренным - пользоваться при
фокусировке объектива. Так, у объективов с увеличением 8х, 40х и 90х
рабочие расстояния соответственно 13,8; 0,6 и 0,12 мм. Для иммерси-
онного объектива рабочее расстояние составляет 0,12 мм, поэтому его
нередко называют "близоруким". У объективов малых увеличений не
только большие рабочие расстояния, но и большие поля зрения. В связи
с этим рекомендуется начинать исследование препарата с небольшого
увеличения.

Объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной
0,17+0,1 мм. Если стекло не соответствует стандарту, необходимо
регулировать объектив вращением кольца коррекционной оправы,
которой оснащены современные высококачественные объективы. При
отсутствии такой оправы сферическую аберрацию, вызываемую покровным стеклом, следует устранить, поднимал или опуская тубус микроскопа.

Одна из важных характеристик объектива - разрешающая способность, определяющая в конечном итоге разрешающую способность
микроскопа в целом. Она определяет наименьшее расстояние между двумя точками на препарате, которые будут видны раздельно. Разре­шающая способность объектива (d) зависит от его числовой (численной) апертуры (А) и длины волны света (λ), при которой идет наблюдение объекта: d = λ /А.

Длина волны света, воспринимаемая человеческим глазом, сос­тавляет 0,4...0,7 мкм. Отсюда среднее значение λ = 0,55 мкм.

При определении разрешающей способности микроскопа следует различать два случа я: освещение прямое (лучи падают параллельно оптической оси микроскопа) и косое. При косом освещении разреша­ющая способность микроскопа бывает в два раза меньше, чем при прямом: d = λ /2А.

Предел разрешающей способности объектива или наименьшее значение величины d можно представить следующим образом. Пусть значение λ - наименьшее (для более коротких, чем видимые, ультра­фиолетовых лучей оно равно 350 нм), а значение А - максимальное (в наиболее совершенных иммерсионных системах 1,4...1,6). В этом случае разрешающая способность объектива будет наибольшей по физическому смыслу и наименьшей по абсолютной величине.

Для условий работы наших микроскопов величина λ постоянна, так как объекты исследуются при обычном свете (λ= 0,55 мкм). Следова­тельно, предел разрешающей способности зависит исключительно от возможности повышения числовой апертуры. Числовая апертура объек­тива характеризует его светособирательную способность и определя­ется по формуле A=n sin 1/2ά

где n - показатель преломления светового луча, проходящего через предметное стекло в среду между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом;

ά - угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, другая образована линией, соединяющей точку выхода эффективных лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива;

1/2ά - половинный угол входного отверстия объектива.

Важно, чтобы значение величины n было максимальным. Повысить ее можно введением в промежуток между фронтальной линзой объек­тива и предметным стеклом среды с n, близким к n стекла. На практике это достигается использованием иммерсионных объективов с введением кедрового масла (n= 1). Дальнейшего повышения n можно достичь введением среды с показателем преломления более высоким, чем у стекла.

Важно также, чтобы значение величины sin 1/2ά было максималь­ным. Чем больше sin 1/2ά тем выше числовая апертура и разрешающая способность объектива. Предел повышения sin 1/2ά зависит от степени кривизны фронтальной линзы (это учитывается при изготовлении иммерсионных объективов) и числовой апертуры конденсора.

Высокоапертурные объективы применяют только одновременно с
высокоапертурным конденсором. Если апертура конденсора меньше апертуры объектива, то возможности последнего оказываются не полностью использованными.

Окуляр служит как бы непосредственным продолжением "линз" человеческого глаза. Преломляющую систему глаза можно рассматривать как двояковыпуклую линзу со средним фокусным расстоянием
15 см (расстояние наилучшего зрения 25 см). Тесная связь с глазом
человека отражена в названии окуляра. Окуляр состоит из двух линз - глазной (верхней) и полевой, или собирательной (нижней), заключенных в металлическую оправу. Назначение полевой линзы - собирать лучи, идущие от объектива, таким образом, чтобы они проходили через маленькое отверстие глазной линзы.

Назначение окуляра - увеличение действительного обратного и увеличенного изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра выгравировано на оправе. Рабочее увеличение окуляров колеблется в пределах от 4х до 15х. Собственное увеличение окуляра вычисляют по формуле, применяемой для определения увеличения луп: К = L/F,

где L - расстояние наилучшего зрения, равное 25 см; F фокусное расстояние линз
окуляра.

Окуляры бывают различных типов. Выбор их зависит от объектива. С ахроматическими объективами малых и средних увеличений и планахроматами малых увеличений применяют окуляры Гюйгенса или ортоскопические окуляры; с апохроматическими, планахроматическими и ахроматическими объективами больших увеличений - компенсационные окуляры. Окуляры Гюйгенса состоят из двух плоско-выпуклых линз, обращенных выпуклой стороной к объективу. Нижняя линза обычно имеет больший диаметр и большее фокусное расстояние, чем верхняя. Фокальная плоскость окуляров Гюйгенса располагается между глазной линзой и линзой поля зрения

При длительной работе с микроскопом следует пользоваться
двойными окулярами - бинокулярной насадкой. Бинокулярные насадки
часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и снабжены коррекционными линзами. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55...75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Работа с бинокулярной насадкой улучшает видимость объекта, снижает яркость изображения и тем самым сохраняет зрение.

ОСНОВНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОСКОПА

Качество микроскопа определяется его увеличительной и разреша­ющей способностями.

Увеличительная способность микроскопа. Коэффициент увеличения микроскопа определяется произведением увеличения окуляра (К) и увеличения объектива (V): D= КV.

Теоретически микроскоп может дать увеличение 2000х раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличения микро­скопа. Пределы полезного увеличения в обычно используемых микро­скопах достигают 1400х. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света, которые незаметны в пределах полезного увеличения, но приводят к оптическим ошибкам в зоне бесполезных увеличений.

Увеличение, которое дает возможность рассматривать объект под предельным углом зрения, и есть полезное увеличение. Оно обычно превышает числовую апертуру объектива в 500...1000 раз. Например, для объектива с увеличением 40х, имеющего числовую апертуру 0,65, полезное увеличение составляет 325...650х, Такое увеличение позволяет различить все структуры, разрешаемые данным объективом. Поэтому для объектива 40х следует брать окуляр 15х, чтобы получить общее увеличение в пределах полезного.

Какие бы более сильные окуляры ни применялись, более тонких деталей структур выявить не удастся. Более того, применение окуляра с большим увеличением приведет к уменьшению количества света, попадающего в глаз наблюдателя, и возрастанию искажений, вызыва­емых дефектами зрения.

Если объектив имеет увеличение 90х (числовая апертура 1,25), то полезное увеличение для него равно 1250х. Следовательно, и здесь не надо применять окуляры с увеличением более 15х, чтобы не выходить за пределы полезного увеличения. Бесполезные увеличения могут при­нести пользу лишь при подсчете мельчайших частиц в поле зрения, если при этом не требуется рассмотрения их структуры.

Разрешающая способность микроскопа. Эта характеристика особенно важна при исследовании микрообъектов- и их структур. Если увеличительная способность микроскопа зависит от объектива и окуля­ра, то разрешающая способность определяется главным образом объективом и конденсором/

Расчет разрешающей способно­сти микроскопа проводят по формуле d = λ /2А.

Максимальная разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм. Разрешающая способность микроскопа тем лучше, чем меньше абсолютная величина d.

Пример расчета разрешающей способности микроскопа. Если увеличение объектива V -=40х, А = 0,65, то

d=0,55мкм / 2х0,65=0,42 мкм

если V -=90х, А = 1,25, то d=0,55мкм / 2х1,25=0,22 мкм

Список рекомендуемой литературы.

1. Ландсберг Г. С. Оптика. М.: Наука 1976г.

2. Сивухин Д.В. Курс общей физики. Оптика. М. 1986г.

3. Савельев И. В. Курс общей физики. Т 2, 3 изд, испр. М.: Наука. 1982г.

4. Физический практикум. Электричество и оптика. (Под ред. Ивероновой В. И. М.: Наука. 1968г.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 998 | Нарушение авторских прав