АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Материалы и методы. Культивирование водорослей и обработка токсикантами.Объектом служила альгологически чистая культура зеленой водоросли C

Культивирование водорослей и обработка токсикантами. Объектом служила альгологически чистая культура зеленой водоросли C. moewusii Gerloff, Lewin 1002, CALU 228 (flagellaless mutant), полученная из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии С-Петербургского государственного университета. В отличие от дикого типа у клеток данного штамма на всех стадиях роста на всех исследованных средах полностью отсутствуют жгутики. Культуру выращивали при 25⁰С фототрофно на трис-ацетат-фосфатной среде, pH 7.0 при интенсивности освещения люминесцентными лампами 30 мкЕ/м²с и продолжительностью светового и темнового периодов 14 и 10 ч, соответственно. Культуру, достигшую стационарной фазы роста, разливали в условиях стерильности по 100 мл в колбы объемом 250 мл и вводили изучаемые соль метилртути (MeHg chloride) (Aldrich Chemical Company, Inc. USA). Водоросли экспонировались от нескольких часов до двух суток при разных концентрациях солей метилртути в тех же условиях, что и при выращивании культуры. Концентрация клеток перед добавлением препаратов составляла 250 тыс. кл. мл^-1.

Численность микроводорослей определялась микроскопически методом прямого счета в камере Горяева (V=0,0001 мл) при трехкратном ее заполнении.

Измерения флуоресцентных показателей водорослей проводили на импульсном флуорометре WaterPAM (Walz, Германия). В адаптированных к темноте образцах регистрировали постоянную (Fо) и максимальную флуоресценцию (Fm), а также относительный выход переменной флуоресценции (Fv/Fm) у водорослей, который является мерой максимальной потенциальной квантовой эффективности фотосистемы 2 (ФС 2). На свету проводили измерения быстрых световых зависимостей различных параметров флуоресценции на свету при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 400 мкЕ/м² с (White, Critchley, 1999). Время освещения составляло 50 секунд. В работе (Serodio et al., 2005) показано, что за этот период проходят быстрые адаптационные изменения в фотосинтезе водорослей при увеличении интенсивности света. В конце каждого сеанса освещения при определенной интенсивности с использованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 мкЕ/м² с), регистрировались параметры Fm', а также выход флуоресценции на свету F(t) (Schreiber et al., 2004). На основании всех параметров рассчитывали - нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ=(Fm-Fm')/ Fm', квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в фотосистеме 2 как отношение Y= (Fm'-Ft)/Fm' и относительную скорость нециклического электронного транспорта при данной интенсивности света ETR. Скорость транспорта электронов рассчитывали по формуле ETR = Y х E_i, х 0,5, где E_i – освещенность, (мкЕ/м² с) (Lippemeier et al., 1999). На основании полученных световых кривых (Р/Е кривых) оценивали следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона Р/Е кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (ETR_max) и насыщающую интенсивность света (Е_н). α рассчитывали как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам, лежащим на светолимитированном участке Р/Е кривой, ETR_max - как среднее по значениям ETR, находящимся на светонасыщающем участке (Jassby, Platt, 1976). Е_н рассчитывали по формуле Е_н = ETR_max / α. (Platt et al., 1977; MacInture et al., 2002). Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой (van Kooten, Snel, 1990 Schreiber et al., 2004). На импульсном флуориметре М-РЕА2 (HansaTech, Англия), проводили одновременно регистрацию индукции быстрой и замедленной флуоресценции, а также изменений Р₇₀₀ по поглощению при длине 820 нм с высоким временным разрешением (начиная с 0,01 мс) [8,13].

Регистрация быстрой и замедленной флуоресценции производится при чередовании актиничного света (627нм, 1200 мкЕ/м²с) и темновых интервалов. Перед измерением образцы водорослей концентрировали на мембранном фильтре, затем отфильтрованный образец помещали в измерительную ячейку и выдерживали в темноте в течение 10 мин. Важно отметить, что измерения на флуориметре М-РЕА2 выполняются только на клетках, предварительно отфильтрованных на поверхность мембранного фильтра. Ранее проведенные контрольные измерения на флуориметре Aqua-Pen в кюветах показали, что применение процедуры обогащения проб на фильтре не влияло на физиологическое состояние клеток [8].

Для флуоресцентных измерений использовали культуру водоросли на экспоненциальной фазе роста (2 сут). Исследуемые вещества добавляли к суспензии клеток, инкубировали в течение 24 часов и проводили измерения. Концентрация клеток перед добавлением препаратов составляла 250 тыc. кл. мл^–1.

Все измерения проводили в 5 повторениях. На рисунках приведены результаты характерных опытов, повторяющиеся не менее 3 раз.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 385 | Нарушение авторских прав