АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Принципы и методы диагностики вирусных инфекций

Система мероприятий по борьбе с вирусными инфекциями включает: диагностику лечение и профилактику.

Диагностика играет решающую роль в системе мероприятий по борьбе с болезнями вирусной этиологии

Диагноз (от греческого слова diagnosis - распознавание) это определение характера и существа болезни, установление ее причины и формы. Процесс постановки диагноза называется диагностикой. Она складывается из трех этапов:

1 этап - наблюдение и исследование больных животных;

2 этап - анализ и оценка результатов исследования

3 этап - заключение о причине, форме болезни и состоянии больного организма.

Быстро и правильно поставленный диагноз это 50% успеха в борьбе с вирусной инфекцией, а именно он позволяет принять целенаправленные меры по ее ликвидации с наименьшими потерями. Вспышку вирусной инфекции можно сравнить с пожаром. Чем раньше замечено «возгорание» и чем раньше начали «тушить», тем меньше ущерб.

Пример: на птицефабрике под Ленинградом в 1986 году вспыхнула нъюкаслская болезнь. Диагноз был поставлен только через 2 недели и ошибочный (на грипп). В результате запоздалого и неправильного диагноза потеряли 3 млн. голов птицы. Пример показывает, что именно в руках ветеринарных врачей экономика страны. Поэтому диагноз на вирусное заболевание должен быть поставлен как можно быстрее и как можно точнее.

При подозрении на любое инфекционное заболевание, в том числе и вирусное диагноз устанавливается комплексно, на основании следующих данных:

1 эпизоотологических данных

2 данных клинического обследования

3 данных патологоанатомического обследования

4 данных лабораторных исследований

В процессе постановки диагноза различают два этапа:

Первый – клинико-эпизоотологический. Проводится этот этап непосредственно на месте возникновения вирусной инфекции (в хозяйстве, питомнике, птицефабрике). На основании собранных данных (эпизоотологических, клинических и патологоанатомических) устанавливают предварительный диагноз.

Второй – лабораторной диагностики. Проводится в специализированном учреждении – вирусологической лаборатории или отделе. В нем проводят исследование материала, полученного с места возникновения вирусной инфекции и с учетом предварительного диагноза. На основании полученных результатов лабораторных исследований устанавливается окончательный диагноз на вирусную инфекцию.

Первый этап начинается со сбора и изучения эпизоотологических данных. Сюда входят сведения о наличии в данной местности вирусных инфекции и каких; о количестве заболевших животных их вид, возраст, пол, физиологическое состояние; о сезонности заболевания, наличии переносчиков и резервуаров инфекции, контактах животных с источником инфекции; скорость распространения заболевания; о поступлении новых животных, перегруппировках животных, прививках и напряженности иммунитета. Например, для ящура характерно: встречается в пограничной зоне на границе с неблагополучной по данному заболеванию территорией болеют только парнокопытные, быстрый охват поголовья за короткий промежуток времени, переносчиками могут быть любые животные и птицы и человек, продукция животного происхождения и т.д. Клиническое обследование больных животных начинают с габитуса (температура, пульс, дыхание, положение тела в пространстве, темперамент, конституция, упитанность и т.д.) и анамнеза. Затем проводят исследование каждой системы организма, отмечая отклонение от нормального состояния.

Патологоанатомические изменения устанавливают при вскрытии павших или вынужденно-убитых животных. Отмечают изменение органов и тканей по сравнению с нормой, наличие новообразований.

В ряде случаев клинико-морфологические изменения настолько типичны, что можно поставить диагноз (оспа, ящур). Однако часто заболевание протекает нетипично или признаки болезни наблюдаются сразу при нескольких инфекциях. Кроме того последнее время встречаются смешанные инфекции, когда болезнь вызвана не одним, а двумя и более этиологическими агентами (двумя вирусами или вирусом и бактерией).

Другой пример, когда даже при такой инфекции как ящур обязательны лабораторные исследования для определения типа и подтипа, так как иммунитет защищает только от того типа вируса ящура на который образовался.

Поэтому во всех случаях предварительный диагноз необходимо подтверждать лабораторными исследованиями.

Таким образом в результате клинико-эпизоотологического анализа из сотни вирусных болезней ветеринарный врач останавливается на 2-3 инфекциях и указывает их в сопроводительном документе для биоматериала, который отправляется им в вирусологическую лабораторию.

Результаты лабораторных исследований во многом зависят от правильности взятия и отправки биоматериала (патологического) материала для этих исследований.

Основные требования к взятию и пересылки биоматериала следующие:

1 Материал берут в начале клинического проявления вирусной болезни. Так как максимально содержание вируса в тканях организма наблюдается именно в этот период инфекции и сохраняется на достаточном уровне всего несколько дней. После 7-8го дня болезни и особенно если животное погибло выделить вирус из взятого материала практически невозможно.

2 Материал должен быть свежим. Это значит, что материал бе5рется не позднее 1-2 часа после смерти или вынужденного убоя животного. Так как титр вируса в тканях после смерти животного быстро снижается в результате аутолиза тканей и размножения микроорганизмов.

3 При взятии биоматериала соблюдают стерильность. Чем меньше контаминация материала другими микроорганизмами, тем легче обнаружить и выделить истинного возбудителя инфекции.

4 При взятии биоматериала учитывают тропизм вируса и отбирают те ткани и органы в которых вирус репродуцируется и накапливается в организме.

5 Взятый материал, если невозможно немедленно доставить в лабораторию консервируют для того, чтобы сохранить активность вируса. Для этого чаще всего используют замораживание биоматериала или консервируют его, погружая в 50% стерильный раствор глицерина.

Весь порядок отбора проб патматериала, его консервирования и транспортировки при конкретных вирусных инфекциях регламентирован специальным наставлением Ветеринарного законодательства том 2 стр. 155.

В вирусологической лаборатории полученный биоматериал принимают регистрируют и подготавливают к исследованию. Для этого его распечатывают, освобождают от консервантов, взвешивают и делят на 2-3 порции (одну часть материала хранят до окончания исследований). Часть материала в необходимых случаях отдается для бактериологического и микологического исследования

Приняв во внимание содержание сопроводительного документа составляется план исследований на те вирусные инфекции, которые указаны в нем.

Существует три направления лабораторной диагностики вирусных инфекций:

1 Обнаружение вируса или следов его пребывания в биоматериале с помощью экспресс методов.

2 Выделение вируса из биоматериала и его идентификация.

3 Ретроспективная серологическая диагностика вирусных инфекций.

Главная цель лабораторных исследований сводится к получению быстрого и точного результата, поэтому биоматериал изучаю не менее чем двумя методами разных направлений.

Первый метод позволяет получить по возможности быстрый ответ, а второй метод (более надежный) должен подтвердить результат первого. Такая методика исследований дает уверенность в правильности полученного результата. А по этому результату лабораторного исследования биоматериала ставится окончательный диагноз на вирусную инфекцию.

Рассмотрим, подробнее какие методы входят в каждое направление лабораторной диагностики.

К первому направлению лабораторной диагностики относят экспресс-методы

1 группа методов позволяет обнаруживать в биоматериале геномы (нуклеиновые кислоты) вирусов. Это метод ДНК-зондов и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Наиболее часто в лабораторной диагностике используют ПЦР. На настоящий момент данная реакция является самой чувствительной и специфичной, позволяя выявить до одной молекулы нуклеиновой кислоты вируса в абсолютно любом исследуемом материале.

2 группа методов позволяет обнаруживать в биоматериале вирусные антигены. Вирусы имеют специфичные для каждого вида белки в составе капсида, суперкапсидной оболочки (наружные антигены)и сердцевины (внутренние антигены). Поэтому, располагая диагностическими специфическими сыворотками или иммуноглобулинами к определенным антигенам вируса, можно обнаружить вирус в биоматериале с помощью серологических реакций. Наиболее чувствительные из них это реакция иммунофлуоресценции-РИФ (МФА), иммуноферментный анализ – ИФА, радиоиммунный анализ –РИА. Близка по чувствительности РНГА. Менее чувствительными являются реакция диффузионной преципитации – РДП, реакция связывания комплемента- РСК и другие.

Все реакции основаны на взаимодействии специфических антител с гомологичными вирусными антигенами с образованием комплекса антиген-антитело. Обнаруживают комплекс разными способами. Так в РИФ по свечению красителя связанного со специфическими антителами под люминесцентным микроскопом, в ИФА по действию фермента связанного со специфическими антителами, в РИА по радиоактивному излучению изотопа связанного с антителами, в РНГА по агглютинации сенсибилизированных (нагруженных) антителами эритроцитов, в РДП по линии преципитации в агаровом геле, в РСК по изменению гемолитической системы,которую добавляют к реакционной смеси и тд.

РИФ, ИФА и РИА, РНГА универсальны, просты в технике исполнения, нетребовательны к стерильности материала и позволяют в течение 2-4 часов получить результаты.

Для РСК и РДП требуется около двух суток, чтобы получить ответ, поэтому в настоящее время применяются реже. РСК для определения типа вируса ящура, РДП в диагностике бешенства ИРТ крупного рогатого скота, чумы собак (можно использовать даже гниющий материал).

4 метод это обнаружение вирусных гемагглютининов в биоматериале. Гемагглютинины представляют собой поверхностные рецепторы вируса, которыми он может адсорбироваться на эритроцитах и склеивать их. Выявляют такие вирусы с помощью реакции гемагглютинации (РГА).

Гемагглютинирующая активность штаммов вирусов не одинаковая одни могут другие нет. Условия гемагглютинации тоже разные: рН, температура (4, 22, 37 С), наличие ионов Са, натрия магния видовая принадлежность эритроцитов (пол, возраст, физ состояние). Гемагглютинирующие свойства у вирусов более устойчивые чем инфекционные, поэтому они могут проявлятся даже когда вирус не проявляет инфекционность. РГА применяют для обнаружения в биоматериале вируса гриппа, вируса парагриппа, вируса ИРТ. Например: распределение вируса гриппа и вируса нъюкаслской болезни в организме кур и цыплят различно. При гриппе в селезенке печени и легких кур и цыплят всегда обнаруживают много гемагглютинина 1:1024, тогда как при ньюкаслской болезни гемагглютинины обнаруживают только у 20 дневных цыплят 1:128, а у кур их нет. Таким образом этим методом можно дифференцировать эти две болезни в течении 2х часов.

Присутствие вирусных гемагглютининов часто маскируется присутствием ингибиторов сложного состава, поступающих из клеток тканей, в которых размножался вирус. Их можно удалять нагреванием, обработкой ацетоном, эфиром трипсином, высокоскоростным центрифугированием.

Но часто в биоматериале концентрация вируса недостаточная и поэтому в основном эту реакцию применяют после накопления вируса в живой системе.

5 группа методов позволяет использовать микроскопию для обнаружения вирионов вируса в биоматериале. Первый метод это вирусоскопия- обнаружение крупных вирусов под световым микроскопом после специального окрашивания, которое позволяет увеличить и контрастировать вирионы. Вирусоскопия применяется лишь для диагностики оспенных инфекций, так как только вирус оспы можно увидеть под световым микроскопом.

Вирионы других вирусов обнаруживают под электронным микроскопом. Этот метод диагностики является довольно дорогим, так как требует дорогостоящего оборудования, специального персонала и сложной подготовки материала для исследования. Кроме того, по морфологии вириона можно лишь определить его семейство, но не вид. Поэтому этот метод применяется ограниченно. Однако в некоторых случаях данный метод является основным при диагностике некоторых вирусных инфекций при, которых вирус не удается выделить или обнаружить его в серологических реакциях (парвовирусный энтерит собак) или в случае, когда необходимо быстро поставить диагноз (корона-рота вирусные инфекции).

Проблему с идентификацией вируса под электронным микроскопом позволяет решить использование специфических антител. Электронная микроскопия с их использованием называется иммунноэлектронной микроскопией. Препараты для микроскопии обрабатывают специфическими антителами к определенному виду вирусу и просматривают под электронным микроскопом. В положительном случае, если вирус и антитела гомологичны то в поле зрения будут видны вирионы, окруженные антителами.

Метод люминесцентной микроскопии применяется не только для просмотра результатов МФА, но и для обнаружения скоплений вируса в клетках путем простого флуорохромирования, позволяющего усилить естественное свечение нуклеиновых кислот вируса. Но таким образом можно определить лишь группу вируса - ДНК- или РНК- содержащий.

6 метод это обнаружение в клетках тканей вирусных телец включений. Внутриклеточные тельца включения образуются при многих вирусных инфекциях и являются специфичными для каждого вида вируса по строению, по расположению, по краске и т.д. Поэтому данный метод используется в исследованиях на бешенство, чуму собак, оспенные и аденовирусные инфекции.

7 группа методов это биопроба и иммунологическая проба. Эти методы тоже относят к экспресс- методам, хотя и условно из-за их длительности (от 1 суток до 30).

Биопроба это экспериментальное заражение патматериалом лабораторных или естественно-восприимчивых животных. Применяется для воспроизведения характерных клинических и патологоанатомических признаков для данного вирусного заболевания. Например балезнь Ауески воспроизводят на кроликах, бешенство -на мышах, ящур -на морских свинках и т.д. Естественно-восприимчивые животные используются для биопробы редко и только случаях воспроизведения типичных клинических признаков болезни (оспа овец, коз, чума свиней инфекционная анемия лошадей)

Иммунологическая проба это биопроба на иммунных и неиммунных организмах. Она позволяет дифференцировать заболевание.

Биопробу чаще ставят на лабораторных животных, но и она не всегда гарантирует точный результат.

В целом все рассмотренные экспресс-методы позволяют достаточно быстро дать ответ на наличие вируса в исследуемом материале и его вид, однако достоверность большинства методов не высока, чтобы на их основании ставить окончательный диагноз и поэтому нуждаются в подтверждении более надежными.

В связи с этим одновременно с проводимым экспресс-методами по возможности лаборатории проводят работу по второму направлению лабораторной диагностики, которое заключается в выделении и идентификации вируса.

Выделяют вирус на живой системе. Для этого вирусной суспензией из патматериала заражают лабораторных животных или куриные эмбрионы или культуру клеток. При выборе живой системы учитывают чуствительность ее к выделяемому вирусу, вид животного вид биоматериала, предварительный диагноз, тропизм вируса и т.д. Например если материал получен от кур заражают куриные эмбрионы, если от млекопитающих, то заражают культуру клеток того же вида, если вирус поражает ЦНС то заражение проводят интрацеребрально, если печень, то внутрибрюшинно.. Признаками размножения вируса в организме лабораторных животных служат клинические симптомы, гибель и патологанатомические измения, в куриных эмбрионах это гибель, патологоанатомические изменения или гемагглютинирующие свойства экстраэмбриональных жидкостей, в культурах клеток это цитопатический эффект или явление гемадсорбции. Адаптация вируса к живой системе может быть длительной, поэтому проводят до 4-5 слепых пассажей. При отрицательном результате слепых пассажей исследование прекращают, но это не означает отсутствие вирусной инфекции у исследуемого животного. Причиной может быть неправильное взятие и неправильная пересылка биоматериала, в результате чего вирус инактивировался или его просто не было в нем.

Идентификацию вируса проводят путем изучения его свойств. Изучают его строение, наличие гемагглютинирующей активности, способность к гемадсорбции, вид цитопатогенного действия на культуре клеток. Конечно определение типа симметрии количества капсомеров, формы вируса невозможно в пределах практических лабораторий. Поэтому разработаны более простые тесты, с помощью которых можно установить принадлежность выделенного вируса к определенному семейству. К ним относят размер вириона, устанавливаемый по фильтрации через фильтры с разным размером пор, определение чуствительности к эфиру, устойчивость при рН 3,0, применение производных дезоксиуридина, подавляющего размножение только ДНК-содержащих вирусов и позволяющее таким образом установить тип нуклеиновой кислоты изучаемого вируса.

Но точно установить вид вируса можно только в серологических реакциях с диагностическими сыворотками. Выбор реакции зависит от свойств вируса и возможностей лаборатории. Так гемагглютинирующие вирусы идентифицируют в РТГА, РТГАД, другие вирусы в РН, РНГА,РДП, РСК, МФА, ИФА.

Если исследования проводились на том же виде животных, от которого был взят биоматериал для исследования, и если у зараженных животных наблюдались те же клинические признаки, то это говорит о положительном результате исследований. Выделение же вируса на других живых системах не всегда является доказательством этиологии болезни, особенно если вирус выделен их дыхательных путей или кишечника, где часто имеется бессимптомное вирусоносительство. Кроме того, ложноположительные результаты могут быть получены в связи с выделением латентных вирусов от животных или с культур клеток. В этих случаях нужно доказать этиологическую роль выделенного вируса. Одним из методов может быть воспроизведение болезни на естественно- восприимчивых животных. Но кроме того,что это дорого, может болезнь и не воспроизвестись. Поэтому в независимости от результатов этого направления лабораторной диагностики проводят исследования по третьему направлению.

К третьему направлению лабораторной диагностики относят серологическую ретроспективную диагностику.

Ретро (назад) означает, что проводится диагностика прошедшего заболевания. Этот вид диагностики предполагает серологические исследования сывороток крови больных и переболевших животных на наличие антител к исследуемому вирусу. Необходимо иметь в виду, что положительный результат одноразового исследования, даже если титр антител высок, не имеет диагностической ценности. Исключением может быть ситуация,когда на данной территории появляется совершенно новый вирус. Присутствие антител в крови может быть следствием ранее перенесенной болезни, бессимптомной инфекции или вакцинации. Положительный результат такого исследования свидетельствует лишь о контакте животного с вирусом, но не определяет, когда это было. Серологические исследования имеют диагностическое значение, когда выявляется нарастание титра антител к определенному вирусу. Для этого у животных берут две пробы сыворотки крови, первый раз в начале заболевания, а второй раз через 2- 3 недели, когда уже исчезают клинические признаки болезни. В обеих сыворотках, используя серологические реакции, определяют титр антител к предполагаемому возбудителю инфекции. Если титр антител возрастает в 4 или более раз, то это является доказательством, что в организме животного протекало инфекционное заболевание, вызванное тем возбудителем, к которому определяли антитела в сыворотках крови. Для этих серологических исследований чаще всего применяют РН, ИФА, РТГА, РНГА. Наиболее достоверные результаты дает РН, которая позволяет обнаружить вируснейтрализующие антитела, ответственные за защиту организма от вирусной инфекции. Несмотря на ретроспективность диагностики, это направление вирусологических исследований является высоко достоверным, дает представление о широте распространения инфекции, динамики ее проявления (нарастание или снижение числа серопозитивных животных) и позволяет принимать эффективные меры по ликвидации вирусной инфекции, проводить специфические и общие ветеринарно-санитарные мероприятия, обеспечивающие устойчивое благополучие хозяйства в отношении той или иной вирусной инфекции.

Серологические методы исследования должны широко применятся и для оценки поствакцинального иммунитета. Хорошо известно,что титр поствакцинальных антител и процент серопозитивных животных для практического ветеринарного врача служит надежным ориентиром при решении вопроса о целесообразности повторных прививок. Так на птицефабриках в настоящие время сроки вакцинации по гриппу птиц определяют на основании результатов систематических серологических исследований 10-15% поголовья. Аналогичные «службы иммунитета» должны быть организованы и для животноводческих хозяйствах. Такая служба позволила бы правильно оценивать напряженность колостерального и поствакцинального иммунитета и планировать сроки вакцинации всех групп животных

Ретроспективная идентификация типов и вариантов вируса прошедшей инфекции не менее важна для специфической профилактики,а также в экологическом аспекте позволяет знать спектр межвидовой циркуляции того или иного вируса.

Таким образом диагностика каждой вирусной инфекции ставится только комплексно, на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и особенно лабораторных исследований, которые являются решающими в постановке окончательного диагноза. Для получения быстрого и точного результата лабораторных исследований сочетают несколько методов разных вирусологических направлений, что позволяет быть твердо уверенным в достоверности исследований.

Дата добавления: 2015-07-23 | Просмотры: 2972 | Нарушение авторских прав