 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Изготовление срезов (резание материала)Ткань, которую необходимо подвергнуть микроскопическому исследованию, режется, разлагается на срезы с помощью особых аппаратов, получивших название микротомов. Наиболее распространенным из них является санный, описание его приводится в данном методическом указании. Этот аппарат состоит из массивной металлической подставки - основания с вертикальной и боковой, расположенной под острым углом, пластинами с хорошо отшлифоваными полосками - полозьями, по которым скользит в горизонтальном положении трехгранный брусок - ножевые салазки с отшлифованными поверхностями, совпадающими с полосками угла На ножевые салазки - ножедержателе находится специальный паз с винтом для крепления микротомного ножа из прочной стали, заточку лезвия которого проводят под контролем микроскопа Поледнее объетоятелтво необходимо учитывать на практических занятиях и ни в коем случае не извлекаь микротомный нож без разрешения дежурного лаборанта или. ассистента, проводящего лабораторный практикум. При помощи зубчатки можно изменять наклон ножа в горизонтальной плоскости (винт изменения наклона ножа), а за счет барашкового зажима - угол поворота ножа, что дает возможность наиболее удобно ориентировать его к блоку и оптимально приготовлять срезы. С левой стороны располагается приспособление для равномерного поднятия подлежащего резанию объекта. Зажим с препаратом продвигается по наклонной плоскости при помощи горизонтального микрометрического винта На дужке винта нанесена шкала указывающая на какое расстояние вверх поднимается блок соответственно повороту части винта (цена одного деления -1 мкм). Зажим с объектом (объектодержатель) при помощи винтов можно установить за счет шарнира в любом направлении и отрегулировать тем самым расположение тканевых элементов в срезах. Срез приготовляется следующим образом: блок устанавливается в нужном положении в объектодержателе; в соответствии с заданным наклоном и поворотом прочнб фиксируется микротомный нож в салазках, причем лезвие его должно находиться выше верхней поверхности
-4- -5-
Для изготовления серийных срезов используются микротомы с вертикально установленным ножом, неподвижно закрепленным в ножедержателе. Блокодержатель подвижен и перемещается с помощью шарнирного винта. Срезы одинаковой толщины подаются на движущуюся ленту и могут быть легко пронумерованы. Подобные микротомы применяются для тотального посрезного изучения отдельных объектов, особенно в эмбриологии. Широкое распространение приобрели микротомы, в которых исследуемый материал может быть разложен на срезы без предварительной заливки в среды благодаря замораживанию. Это дает возможность не только сократить время процедуры получения срезов, но и устранить влияние всякого рода реактивов на тканевые элементы, что особенно важно и даже необходимо для микрохимического, гистохимического и энзимологического исследования. К такого типа аппаратам относятся замораживающий микротом и криостат. Первый и второй имеют объектные столики, микротомные ножи и подающие механизмы, то есть основные части, характерные для вышеописанного санного микротома. В замораживающем микротоме к объектному столику, представленному полой округлой коробкой с выходными отверстиями по лимбу, подведен шланг от металлического балона со сжиженной углекислотой. На поверхность объектного столика с предварительно замороженной водяной подушкой - основой помещается исследуемый материал, смоченный и залитый вокруг отстойной водопроводной водой (применение дистиллированной воды нежелательно по ее криоскопическим данным, излагаемым в курсах практикума на кафедрах общей химии и физики). Затем кусочки медленно замораживают, пуская прерывистую струю углекислоты, и разлагают на срезы необходимой толщины. Цена деления шага ножа устанавливается на горизонтальном полукружном лимбе, по которому движется ножедержатель. В криостатах используется тот же принцип замораживания тканей и ингибирования - Охлаждение в замкнутых камерах, соединенных с двух сторон с эластичными рукавами, Для электронно-микроскопических целей применяется ультратом - специальный микротом, в котором используется стеклянный нож, позволяющий получить сверхтонкие срезы из тканей, залитых в метакрилат, эпоксидные смолы, другие среды. 6. Окрашивание или хроматическая оценка гистологических срезов При различных микроскопических методах, за исключением электронной микроскопии, полученные срезы подвергаются окраске, выявляющей различные структурные элементы тканей и клеток. Для этого применяются красители основные или ядерные, например гематоксилин, окрашивающий ядра клеток от синего до черного цвета; кислые или цитоплазматические, например эозин, тонирующий цитоплазму в красный цвет, пикриновая кислота - в желтый цвет и |др.; нейтральные, например нейтральный красный, для прижизненной окраски клеточных элементов и др. В зависимости от цели исследования применяются многочисленные красители для выявления общей морфологии клетки, для контрастирования кариоплазмы (ядра) и цитоплазмы, допустим, для окраски ядра в красный цвет используются кармин, сафранин и т.д. К специфическим красителям принадлежат: орсеин - окрашивает эластические волокна в коричневый цвет, судан III - окрашивает жир в желтый цвет, а четырехокись осмия - в черный цвет, азотнокислое серебро - импрегнирует нервные клетки и волокна от коричневого до черного цвета, метиленовый синий - окрашивает нервные элементы в синий цвет. Существует множество различных красителей и их комбинаций, применяемых в современной общегистологической технике, но в методическом руководстве для студентов приводятся лишь некоторые из них, с которыми они столкнутся во время изучения гистологических препаратов на лабораторных занятиях, то есть приведенные сведения являются конкретными примерами по изученным препаратам. Наиболее распространенной в этом отношении является окраска гематоксилином и эозином, схема которой приводится ниже. Надо также отметить, что целлоидиновые стрезы окрашевоют без предварительной подготовки, вто время как парафиновые срезы требуют специальной обработки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (водные или спиртовые растворы красителей плохо проникают в парафинезированные ткани), его необходимо удалить из среза Для этого срез подвергают депарафинезацни - процессу, обратному тому, который осуществляется при подготовки объекта к заливке в парфин, т. е. срез последовательно проводят через растворители парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации и затем помещают в воду. После этого приступают к окрашиванию. Окраска срезов гематоксилином-эозином Для окраски срезов по данной методике необходимо предварительно подготовить (тщательно вымыть, обезжирить, просушить) и расставить в последовательном порядке посуду (бюксы, химические стаканчики, чашки Петри или Коха), наполненную водой или растворами, список которых с указанием среднего времени пребывания в них среза приводится ниже. 1. Чашка Коха или Петри с водопроводной водой и срезами в ней. 2. Раствор гематоксилина-5-10 мин. 3. Водапроточная-5-10 мин. 4. Вода дистиллированная-1 -2 мин.
5. Раствор эозина-1-Ю мин. 6. Вода дистиллированная-1-3 мин. 7. Спирт 70°-1-2 мин. 8. Спирт 96°-1-2 мин. 9. Спирт 100°(абсолютный)-1-2 мин.
10. Карбол-ксилол - 1-3 мин. 11. Ксилол - 1-Змин. 12. Бальзам кедровый или канадский (срез помещается в капле бальзама между Во время окрашивания не разрешается нарушать порядок расстановки посуды с растворами. -7-
После заключения среза в бальзам и под предметное стекло, то есть после приготовления так называемого постоянного препарата, он подлежит обозначению -маркировке. Для этого справа и слева от покровного стекла наклеивают этикетки с надписями: слева -описание ткани или органа, объекта, из которого получен материал, справа-метод окрашивания, в необходимых случаях, - фиксация материал и дата изготовления препарата МИКРОСКОП И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ Микроскоп - сложный и самый распространенный в биологии и медицине прибор для изучения мелких деталей организмов, их клеток, тканей и органов. Наиболее важное значение в нем имеют объективы. Оки находятся в непосредственной близости от рассматриваемого объекта, отчего и получили свое название. Объектив состоит из ряда линз, закрепленных в оправе с международной стандартной резьбой в 36 витков в'тубусе микроскопа любой оптической фирмы. Увеличение микроскопа равно произведению цифровых значений объектива и окуляра, скоординированных на тубусе микроскопа, то есть поставленных друг против друга Цена увеличения наносится на обойме объектива и в верхней линишои плашке окуляра (в рабочих студенческих микроскопах значения таковы: объектив х8, х4(), х90 (иммерсионный); окуляр - х7, х!0). Величина линейного увеличения микроскопа будет правильной, иначе истинной, только при длине тубуса в 160 мм. Выдвижные тубусы усиливают увеличение, стланное с искусственным растяжением изображения деталей гистологического препарата В таких случаях истинное увеличение изучаемого элемента должно проводиться с поправкой на длину тубуса. Особенно это важно при использовании рисовального аппарата, передающего на бумагу установленное исследователем увеличение и конфигурацию клеточных и тканевых деталей. Изображение, полученное от простой сферической литы, направленной непосредственно на рассматриваемых объект, страдает двумя недостатками: сферической и хроматической абберациями, суть которых заключается н следующем. Известно, что в двояковыпуклой линзе лучи, более удалены от центра, то есть центральной оптической оси, сильнее преломляются и пересекают главную оптическую ось на сравнительно близких расстояниях от центра линзы. Лучи, расположенные недалеко от оси, будут преломляться меньше и «отодвигаются» от центра линзы. Таким образом, вместо стигматического точечного изображения возникает расплывчатое пятно. Такая погрешность оптической линзы получила название сферической абберации. Количественно сферическая абберация характеризуется продольной абберацией -линейным расстоянием между точками пересечения крайних и центральных лучей с главной оптической осью. Продольные абберации обусловлены материалом линзы и её кривизной. В последнем случае абберации собирательной и рассеивающей линз противоположны по знак); что позволяет, комбинируя такие линзы в объективе, уменьшить сферическую абберацию. Это в микроскопах достигается путем набора линз разной значимости в одном объеме. Кроме сферической, существует хроматическая абберация, связанная с тем, что волны разной длины преломляются неодинаково: фиолетовые - сильнее, красные -меньше всего. В результате этого белое пятно будет цветным, окрашенным во все цвета спектра на усредненном экране. Конечно, такая наслойка дополнительного цвета на окрашенные гистологические препараты нежелательна и должна быть сведена до минимума. Это достигается комбинацией линз из стекла специального состава. Такая система называется ахроматической и в простом варианте состоит из выпуклой линзы, изготовленной из кронгласа (легкого сорта стекла), склеенной с двояковыпуклой линзой из флингпаса (тяжелого сорта стекла). Чаще всего при изготовлении ахроматических систем производят расчет таким образом, чтобы совпали фокусы для двух и более длин света. Все объективы микроскопа делятся на ахроматы - в них устранена абберация двух наиболее ярких.цветов спектра - желтого и зеленого, апохроматы, в которых хроматическая аббераикя устранена почти полностью, и полуахроматы, так называемые флюоритовыс, занимающие среднее положение между вышеназванными объективами. - Для исследования мелких"деталей, особенно при цитологических наблюдениях, используются иммерсионные объективы с высокой разрешающей силой. Чтобы усилить освещенность, в таких системах применяют жидкости, уменьшающие рассеивание света (водная и масляная иммерсия) и заполняющие пространства между полевой линзой, то есть верхней поверхностью конденсора, нижней поверхностью предметного стекла, верхней поверхностью покровного стекла и фронтальной линзой объектива В результате этого полностью исключаются воздушные прослойки на пути светового потока от конденсора до фронтальной линзы. Использование иммерсионного масла, имеющего одинаковый со стеклом и канадским бальзамом коэффициент преломления, создает идеальную гомогенную среду, обеспечивающую возможность различать мельчайшие детали клеток и тканей. Разрешающей силой называется способность объектива «разрешить», показать наименьшее расстояние между двумя близлежащими деталями предмета, при котором они еще видны раздельно. Она выражается формулой с - л/А, где л - длина световой волны, А - числовая апертура Числовая апертура - произведение показателя преломления среды, находящейся между предметом и объективом, на синус половины угла образованного двумя крайними лучами, которые еще проходят объектив. Формула ее такова: А = п х sin и, а значение в цифровом выражении выгравировано ни обойме каждого объектива ниже знака линейного увеличения более мелкими знаками. Таким образом, исследователь освобожден от необходимости вычисления апертуры по приведенной формуле. При подборе объективов для практических целей необходимо всегда обращать внимание на этот показатель: чем больше числовая апертура, тем выше разрешающая сила объектива, следовательно, и всего микроскопа как прибора, так как окуляр в определении разрешающей силы не участвует, что видно из ранее приведенных формул.
-8- -9-
Работать с микроскопом надо не сгибаясь, сидеть без напряжения мышц туловища, свободно- Локти должны плотно опираться на рабочий стол. Пальцы левой руки передвигают препарат, пальцы правой руки работают макрометрическим и микрометрическим винтом (кремальерой), фокусируя отдельные детали в поле зрения. Совершенно необходимо, смотря в окуляр одним глазом, держать второй открытым, чтобы избежать синергичного утомления глазных мышц. Всякое исследование надо начинать при мялом увеличении для ознакомления с общим видом препарата, расположением тканевых структур различного характера, особенностями их окраски/сочетаннем комплексов клеточных структур в различных слоях органа.. При рассеянном искусственном и естественном освещении пользуются вогнутым зеркалом. При точечном источнике света - плоской его поверхностью, регулируя конденсером, особенно при работе с иммерсионными объектами, степень освещенности поля зрения. Перед переходом на большое увеличение нужную деталь, подлежащую изучению, надо установить при малом увеличении в центре зрения и, не поднимая тугуса микроскопа макрометрическим винтом, плавным движением перевести револьвер на большое увеличение и дальнейшую юстировку (отработку четкости изображения) проводить с помощью только микрометрического винта. Не разрешается проводить «грубую» наводку на резкость сразу под большим увеличением, то есть начиная опускать тугус из верхнего положения при большом увеличении под контролем зрения через окуляр. В таких случаях недостаточная квалификация микроскописта приводит при быстром и неумелом обращении макрометрическим винтом к повреждению покровного стекла, самого среза и даже фронтальной линзы объектива. Микроскоп нужно содержать в чистоте, после работы очистить от пыли фланелевой салфеткой или, за неимением таковой, марлевой и предохранить от механических повреждений, не оставлять в местах солнечного освещения и прогревания.. Жидкости, попавшие на части микроскопа во время работы, должны немедленно тщательно удаляться. Кедровое масло (при использовании иммерсионных объектов) и канадский бальзам смываются чистым бензином, эфиром и ксилолом. Последний не рекоментдуется для длительного соприкосновения с линзами объектива, так как может привести к растворекию масс, склеивающих линзы объектива После любого микроскопирования, особенно при цитодиагностике, просмотре не до конца подсушенных препаратов, когда канадский бальзам жидок и может выступать за края покровного стекла и может привести к загрязнению микроскопа, следует обращать тщательное внимание на чистоту оптических частей, особенно фронтальной линзы объектива, Категорически запрещается использовать для снятия засохших иммерсионных масел и бальзама или метакрилатов и их аналогов металлические, стеклянные, деревянные или из органического стекла предметы, если они должны соприкасаться с оптическими частями окуляра или объектива, ограничительными линзами и поверхностью.осветительного комплекса микроскопа (линзы конденсора, поверхности зеркала) L -10- Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 658 | Нарушение авторских прав |
блока. Затем последняя при помощи винта подводится до соприкосновения с режущей частью ножа, который отодвигается за объект. Микрометрический винт поворачивают на желаемое число мкм и плавным движением ножевых салазок к себе делают срез, который снимается с поверхности ножа мягкой беличьей или колонковой кистью и переносится в чашку Петри с водой (для парафиновых срезов - подогретой).
7. Этикетнрование (маркировка) препаратов
Приступая к микрокопированню гистологических препаратов, необходимо помнить следующее: при правильном положении корпуса и соблюдении основных правил даже длительная работа с микроскопом почти не утомляет.