АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ВОПРОС №45: ЦИС-ТРАНС ТЕСТ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОПЫТАХ БЕНЗЕРА.

метод генетич. анализа, позволяющий определить принадлежность двух рецессивных мутаций, имеющих сходное фенотипич. проявление, к одному или разным генам. Предложен Э. Льюисом в 1951. В основе Ц.-т.-т. лежат представления о гене как единице функции. Состоит из двух тестов — транс-теста и цис-теста (последний используют редко). Транс-тест (тест на комплементарность, функциональный тест на аллелизм) заключается в получении гибридов (гетерокарионов), у к-рых две исследуемые мутации находятся на разных гомологичных хромосомах (транс-положение), и анализе их фенотипа. Если обе мутации действуют на разные независимые функции (затрагивают два разных гена), то такой гибрид имеет дикий фенотип, т. к. образуется ди-гетерозигота, в к-рой нормальные аллели доминируют над мутантными. Если исследуемые мутации действуют на одну и ту же функцию (повреждают один и тот же ген), то гибрид должен иметь мутантный фенотип. Этот простой функц. критерий аллелизма, предложенный в 20-х гг. Т. Морганом, усложняется в случаях межгенной некомплементар-ности и межаллельной комплементации. Цис-тест заключается в получении гибридов (гетерокарионов), у к-рых обе исследуемые мутации привнесены одним из родителей, тогда как в хромосомах других содержатся нормальные аллели. Очевидно, что гибриды с цис-положением мутаций должны иметь фенотип дикого типа независимо от того, относятся ли исследуемые мутации к одному или разным генам. Это одна из причин редкого использования цис-теста. Др. причина — трудность получения цис-положения мутаций в случае их тесного сцепления. Однако этот тест совершенно необходим для выявления цис-доминантных мутаций в оперонах. С. Бензер (в 1957) предложил назвать генетич. единицу функции, выявляемую с помощью Ц.-т.-т., цистроном. Термин «цистрон», являющийся синонимом термина «ген», используют в лит-ре редко.Эксперименты С. Бензера показали, что классического гена не существует, поскольку единицей мутации и рекомбинации может служить одна пара нуклеотидов в ДНК. Оставался открытым вопрос о единице функции, и необходимо было выяснить, изменяет ли мутация гена его функцию как единого целого. Для выяснения этого вопроса надо было найти метод, позволяющий определять мутации в различных функциональных единицах.Чтобы определить, принадлежат ли обе мутации к одному или разным генам, С. Бензер применил цис-транс-тест, или тест на комплементарность. Тест на комплементарность основывается на том, что при заражении штамма Е. coli двумя бактериофагами — мутантным (неспособным расти на газоне штамма К) и диким фагом — оба штамма развиваются нормально. Значит, нормальный ген дикого типа способен обеспечив функцию, необходимую для размножения на штамме не только дикого фага, но и rll-мутанта.Было замечено, что в некоторых случаях не только дикий штамм фага способствует росту мутанта на Е. coli, но и два мутанта могут помогать друг другу расти на этом штамме, на котором ни один из них в одиночку не способен размножаться. Для выделения таких комплементарных пар мутантов клетки штамма К заражаются одновременно двумя rll-мутантами, чтобы выяснить, смогут ли они при совместном посеве помогать друг другу и давать потомство. Если два мутанта способны к такому совместному размножению, то можно считать, что обе мутации комплементарны и локализованы в различных функциональных участках фагового генома. Если же два мутанта некомплементарны, значит, они затронули одну и ту же функциональную часть генома. Неспособность одного мутанта расти на штамме К свидетельствует о том, что он не может осуществлять какую-то определенную функцию или синтезировать какой-либо белок, необходимый для размножения фага в клетке. В отличие от первого у второго комплементарного мутанта мутация затрагивает другую функцию. Значит, два таких мутанта могут размножаться при совместном посеве.При совмещении двух мутантных геномов в одной бактериальной клетке в ней будут осуществляться все реакции, необходимые для размножения, так как функции, осуществляемые одним мутантом, будут использованы другим.С помощью теста на комплементарность С. Бензер показал, что мутанты rll разделяются на два класса Л и В. Все мутанты одного класса комплементарны любому мутанту другого класса и не комплементарны мутантам того класса, к которому они сами принадлежат. Наличие двух классов мутантов свидетельствует о существовании двух функциональных единиц в пределах области rll генома фага Т4. Каждая функциональная единица связана, по-видимому, с синтезом специфического полипептида, необходимого для роста на штамме К. Генетическую единицу функции, выявленную с помощью цис-транс-теста, С. Бензер назвал цистроном. Термины «ген» и «цистрон» следует употреблять как синонимы.Путем рекомбинационного анализа можно вычислить длину цистронов А и В в области rll фага Т4. Оказалось, что расстояние между наиболее удаленными точками цистрона А равно примерно пяти единицам карты, а соответствующее расстояние для цистрона В — трем единицам карты. Таким образом, общая длина области rll равна 8% рекомбинации. Исходя из общей длины карты фага Т4 (общая длина карты равна 1500 единицам рекомбинации, 2 — 105 парам нуклеотидов), можно рассчитать, что цистрон А составляет (5/1500) — 2 х 105 = 700, а цистрон В — (3/1500) — 2 х 105 = 400 пар нуклеотидов.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 928 | Нарушение авторских прав