АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Лизогенизация бактерий фазмидами.

Предмет и задачи вирусологии. Связь вирусологии с другими биологическими дисциплинами.

Вирусология является специальной учебной дисциплиной, формирующей полноценного специалиста для работы в условиях реальной ситуации, обусловленной постоянным ростом количества случаев инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами. Целью является изучение биологических и экологических особенностей вирусов как облигатных внутриклеточных паразитов, их роли в патологии животных, а также принципов и методов лабораторной диагностики и специфическрой профилактики вирусных болезней. В задачи входит изучение морфологии и химического состава, принципов систематики и номенклатуры вирусов, особенностей их репродукции и изменчивости, патогенеза и иммуногенеза при вирусных болезнях, а также методических приемов диагностики и специфической профилактики наиболее распространенных и экономически значимых болезней животных, вызываемых вирусами.

Лизогенизация бактерий фазмидами.

Лизогения — это биологическое явление, сущность которого заключается в способности бактериальной культуры в бесчисленном ряду поколений нести в своем составе фаг в особой неинфекционной форме, называемой профагом.

В форме профага вирус не патогенен для клетки, сохраняя, однако, потенциальную способность стать вирулентным при переходе в зрелый (активный) фаг. Профаг находится в клетке либо в интегрированном с бактериальной хромосомой состоянии (например, λ, Р22), либо в виде цитоплазматической частицы. В частности, профаги Р1 и N15 локализу­ются в цитоплазме клетки хозяина, образуя самостоятельный репликон, подобно плазмидам бактерий.

Бактерии, в составе клеток которых есть профаг, называются лизогенными. Они могут лизироваться и высвобождать зрелый фаг (либо спонтанно, либо под воздействием индуцирующих факторов: УФ-из-лучения, ионизирующего излучения, обработки некоторыми кислотами и перекисями и др.). Лизогенные бактерии также иммунны к гомологич­ному фагу.

Лизогенизация — это процесс перехода бактериальной клетки в лизогенное состояние, обусловленный инфицированием умеренным фагом.

Поскольку, как отмечено выше, при лизогенизации геном бактериофага может находиться в автономном от генома бактерии-хозяина состоянии, перенос фазмид в клетки Е. coli также можно назвать лизогенизацией.

На основе ДНК бактериофагов сконструированы несколько типов молекулярных векторов. Векторы внедрения имеют в своем составе один сайт встраивания фрагмента чужеродной ДНК, векторы замещения - два или более места встраивания экзогенных фрагментов ДНК за счет замещения фрагментов векторной фаговой ДНК. Космиды — это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага X (cos-сайт), обеспечи­вающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу in vitro. Созданы клонирующие векторы на основе геномов нитевидных фагов (M13,fd, fl).

Фазмиды — это молекулярные векторы, которые являются искусственными гибридами между фагом и плазмидой. В их составе обнаруживаются фрагменты ДНК бактериофага λ, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а также плазмидная ДНК. Гены репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах сохранены. Перед инфекцией клеток бактерий фазмидные ДНК упаковываются in vitro в капсидные белки фага X, Попадая в клетки, фазмида реплицируется с использовани­ем областей фага X, в результате чего на газоне чувствительных бактерий образуются негативные колонии. Вели же присутствует ген, кодирующий синтез репрессора фага X, то фазмида реплицируется как плазмида. Кроме того, если ген-репрессор кодирует дефектный белок CI, инакти-вирующийся при повышенной температуре (температурочувствительный репрессор), то фазмида реплицируется как плазмида при низкой температуре или как бактериофаг при повышенной.

Техника лизогенизации бактерий Е. coli. Ночную культуру бактерий Е. coli TGI заражают фазмидными частицами и инкубируют при температуре 28 °С. Для этого в пробирку вносят 1 мл ночной культуры бактерий (штамм Е coli TGI) и 0,1 мл фазмиды. Пробирки инкубируют 1 ч при температуре 30 °С. После этого культуру разводят до 10^-1 – 10^-2 и из каждого разведения, а также из неразведенной культуры по 0,1 мл высевают на селективную среду: ПА (полноценный агар) с ампициллином (100 мкг/мл), затем инкубируют 48 ч при температуре 28 °С.

Выросшие колонии рассевают на 2 параллельные чашки, которые инкубируют соответственно при температуре 28°С и 37°С. Для этого дно чашек с наружной стороны маркером делят на 8 секторов, которые нумеруют цифрами от 1 до 8. На одной чашке ставят цифру 28, на другой — 37 (температура инкубирования соответственно). Бактерии из одной колонии петлей засевают в один и тот же номер сектора на чашках, обозначенных 28 и 37. Чашки помещают в термостат с соответствующей температурой на 48 ч. Если бактерии были лизогенизированы (наследовали фазмиду), то их рост при температуре 28 °С выражен лучше, так как при температуре 37 °С будет происходить индукция фага λ, приводящая к гибели клеток.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 347 | Нарушение авторских прав