 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Основы кинетики ферментативного катализаФерментативная кинетика исследует влияние химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия на скорость ферментативной реакции. Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции: [E] + [S] ↔ [ES] → [P] + [E] Фермент [E] образует с субстратом [S] фермент-субстратный комплекс [ES], распадающийся с образованием продукта реакции [P] и свободного фермента [E]. К ферментативным реакциям применимы общие принципы кинетики химических реакций. Любая химическая реакция характеризуется константой равновесия Кр. Для реакции, представленной на схеме, константа равновесия равна отношению произведения концентраций образующихся веществ к произведению концентраций исходных веществ:
В состоянии равновесия скорость прямой (v+1) и обратной (v–1) реакций равны: v+1 = k + 1[ А ] • [ B ] v–1 = k – 1 [ С ] • [ D ], v+1 = v–1 Соответственно k+1[А]•[B] = k–1[С]•[D], или
Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. В случае ферментативной реакции величину, обратную константе равновесия, называют субстратной константой или константой диссоциации фермент–субстратного комплекса и обозначают символом KS.
KS определяет степень сродства субстрата и фермента: чем ниже значение KS, тем выше сродство. Скорость катализируемых ферментами реакций зависит отприроды фермента, обладающего низкой или высокой активностью, а также от концентрации субстрата, наличия в среде активаторов или ингибиторов, т емпературы и реакции среды (рН). При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента:
Важным отличием ферментативных реакций от обычных химических реакций является насыщение фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 6 (а)) является почти линейной, подчиняется кинетике первого порядка и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:
где [S] – молярная концентрации субстрата; –d[S]/dt – скорость убыли субстрата; k' – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин–1 или с–1). При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [ S ]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k" (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента.
Рис.6.Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента: (а) - реакция первого порядка (при [ S ] < Кm скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата); (б) - реакция смешанного порядка; (в) - реакция нулевого порядка, когда v = Vmax и скорость реакции не зависит от концентрации субстрата. . В стационарном состоянии, при котором образование фермент-субстратного комплекса ES уравновешивается его превращением в продукт P, зависимость скорости (v) ферментативного превращения субстрата от его концентрации [S] описывается уравнением Михаэлиса – Ментен:
где KS – субстратная константа, характеризующая активность фермента, Vmax – максимальная скорость реакции при данной суммарной концентрации фермента. Из этого уравнения следует, что при малых [S] скорость реакции возрастает пропорционально концентрации субстрата. Однако при достаточно большом увеличении последней эта пропорциональность исчезает: скорость реакции перестает зависеть от [S] – наступает насыщение, когда все молекулы фермента оказываются занятыми субстратом. Позднее было предложено усовершенствованное уравнение Бриггса-Холдейна:
где Кm представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:
Рис. 4.13. Кривая уравнения Михаэлиса-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакций от концентрации субстрата. В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k–1/ k+1представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса KS, тогда:
Для определения численного значения Кm обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной Vmax, т.е. если v = 1/2 Vmaх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:
Разделив обе части уравнения на Vmах, получим
Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной. При этом в комплексе с субстратом находится половина молекул фермента. Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна по методу двойных обратных величин исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если
или
то после преобразования получаем уравнение:
которое получило название уравнения Лайнуивера–Бэрка. Это уравнение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона который будет равен величине Km/Vmax; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой l/Vmax(обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/Кm (см. рис. 4.14). Таким образом, величину Кm можно вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.
Рис. 4.14. График Лайнуивера-Бэрка. Данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии. Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми-хаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата - кинетическая кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис.).
Рис. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие. Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 1166 | Нарушение авторских прав |
