Методы создания бескислородных условий для культивирование анаэробов
Для создания бескислородных условий используются физические, химические и биологические методы.
Физические методы:
1) посев в глубинуплотных питательных сред (кровяной или сахарный агар): а)посев уколом в высокий столбик агара (анаэробы вырастают в глубине посева); б) посев в трубках Виньяля-Вейона;
2) выращивание на специальных средах: на среде Китта-Тароцци (жидкая питательная среда - 0,5 % глюкоза, кусочки животных тканей, например, печени, которая связывает кислород). Перед посевом среду кипятят и быстро охлаждают. После посева заливают слоем стерильного вазелинового масла.
в) выращивание в анаэростатах – специальный сосуд, из которого удален кислород.
Анаэростат – толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой с резиновой прокладкой. В него ставят чашки Петри (крышкой вверх) с посевами и удаляют воздух или вытесняют инертным газом.
Химические методы - поглощение кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (аппарате Аристовского) химическими веществами (такими как щелочной пирогаллол или гидросульфит натрия).
Биологические методы (метод Фортнера) - совместное выращивание анаэробов и аэробов. После посева чашки Петри герметически закрывают пластилином или парафином. Вначале в чашке Петри размножаются аэробы, а когда весь кислород используется, начинают расти анаэробы.
Выделение чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий.
Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.
Выделение чистой культуры – бактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций.
Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток – специальные методы посева:
а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки;
б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;
Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий.
Выделение чистой культуры проводят в три этапа:
Первый этап (1-ый день):
а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют;
б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37°С на 24-48 часов.
Второй этап (2-ой день):
а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция);
б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий);
в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37°С 24 часа.
Третий этап (3-ий день): проделывают работу по идентификации (определение вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для определения вида изучают морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства:
а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);
б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологические и тинкториальные клетки;
в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитических и протеолитических свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа.
По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.).
В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы).
Выделение чистой культуры анаэробных бактерий также осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом и идентификацией.
Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).
Три этапа:
Первый день. Делают посев (земля, гной) на среду Китта-Тароцци.
Второй день: для получения колоний делают пересев со среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.
Третий день: колонии пересевают в пробирку с новой средой Китта-Тароцци для накопления чистой культуры; проводят идентификацию чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам.
Посев по методу Цейсслера. Каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци последовательно засевают в три чашки Петри с кровяным агаром. Посевы ставят в анаэростат или аппарат Аристовского, которые ставят в термостат. На следующий день на третьей чашке вырастают отдельные колонии. Делают пересев этих колоний на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.
Посев по методу Вейнберга. Пастеровской пипеткой переносят материал со среды Китта-Тароцци последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, погружая пипетку в расплавленный агар до самого дна пробирки. Пробирки быстро охлаждают под холодной водой. Агар застывает и разобщает микробные клетки в глубине агара. Из этих клеток вырастают колонии, которые пересевают в новую среду Китта-Тароцци, накапливают чистую культуру и идентифицируют.
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 963 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 |
|